PLZF對奶山羊雄性生殖干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、雄性生殖干細(xì)胞（male Germline Stem Cells，mGSCs）是定位于雄性動物睪丸中的曲細(xì)精管基底膜上的成體干細(xì)胞。mGSCs不僅能夠通過自我更新來維持自身群體數(shù)量的穩(wěn)定，還可以通過定向分化產(chǎn)生精子，是唯一一種能夠通過自然生殖過程將雄性動物的遺傳信息傳遞到下一代的成體干細(xì)胞。PLZF是一種高度保守的多功能轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，其表達(dá)具有嚴(yán)格的組織特異性和時序特異性，參與機(jī)體的發(fā)育、分化等多種重要的生物學(xué)過程。近年來，PLZF作為

2、非常重要的轉(zhuǎn)錄因子，已引起人們的廣泛關(guān)注。PLZF表達(dá)于未分化的mGSCs，對其多能性的維持、自我更新和分化的平衡以及雄性個體的生育能力維持等具有重要的調(diào)控作用，是被廣泛認(rèn)可的mGSCs的標(biāo)志基因。目前，雖然對PLZF調(diào)控mGSCs自我更新和分化的作用及作用機(jī)制的探索已經(jīng)取得了一些進(jìn)展，但這些研究都是在小鼠等模式動物中取得的。PLZF對山羊等家畜大動物mGSCs的作用及作用機(jī)制卻知之甚少。本研究擬在已有基礎(chǔ)上，探索PLZF對奶山羊mGS

3、Cs生物學(xué)特性的的影響，以進(jìn)一步了解其對精子發(fā)生過程的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建PLZF超表達(dá)和干擾慢病毒載體，轉(zhuǎn)導(dǎo)奶山羊mGSCs，并篩選得到了穩(wěn)定超表達(dá)和干擾PLZF的奶山羊mGSCs細(xì)胞株。并通過免疫熒光染色，qPCR，Western blot，EdU染色，流式細(xì)胞檢測等技術(shù)手段檢測了PLZF對奶山羊mGSCs多能性、自我更新、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)特性的影響。
　　1.PLZF超表達(dá)載體及干擾載體的構(gòu)建和穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)

4、胞株的篩選
　　我們構(gòu)建得到了PLZF慢病毒超表達(dá)載體pPLZF-CDH和PLZF慢病毒干擾載體pshPLZF。然后將慢病毒載體包裝病毒并轉(zhuǎn)導(dǎo)奶山羊mGSC，通過篩選、鑒定得到了超表達(dá)PLZF的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株mGSCs-oePLZF及其對照細(xì)胞株mGSCs-pCDH，干擾PLZF的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株mGSCs-pshPLZF及其對照細(xì)胞株mGSCs-pSIH。
　　2.PLZF促進(jìn)奶山羊mGSCs維持其自我更新和多能性并抑制其分化

5、>　　通過免疫熒光染色、qPCR和Western blot檢測，研究發(fā)現(xiàn)GFRα1、Vasa、CD49fCD90、Oct4、Etv5等與mGSCs自我更新和多能性相關(guān)的基因表達(dá)顯著上調(diào)，而mGSCs的分化標(biāo)志基因c-Kit表達(dá)水平顯著下調(diào)。另外我們通過qPCR檢測發(fā)現(xiàn)Tet1表達(dá)水平顯著下調(diào)，同時Dnmt3a表達(dá)水平顯著上調(diào)，說明PLZF可能促進(jìn)奶山羊mGSCs的DNA甲基化修飾。
　　3.PLZF抑制奶山羊mGSCs增殖，促進(jìn)其

6、凋亡
　　我們通過測定細(xì)胞生長曲線、CCK8檢測、EdU染色、流式細(xì)胞周期檢測、免疫熒光染色、qPCR、Western blot等實(shí)驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)超表達(dá)PLZF的奶山羊mGSCs細(xì)胞增殖速度變慢、細(xì)胞周期在G0/G1期發(fā)生阻滯，細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)。通過細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，移植PLZF超表達(dá)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的白消安模型小鼠睪丸要明顯比對側(cè)移植對照細(xì)胞的睪丸小，且曲細(xì)精管內(nèi)形成的細(xì)胞克隆也明顯比對照組差;相應(yīng)的，移植PLZF干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的睪