年齡因素對人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響.pdf

1、脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(Adipose Derived Stem Cells，ADSCs)是從脂肪組織中提取的一種具有高度自我更新和多向分化潛能的多能干細(xì)胞，可以參與多種組織器官的再生修復(fù)，因其來源充足，取材方便等優(yōu)勢，具有良好的臨床應(yīng)用前景。目前，自體ADSCs已在臨床用于軟組織缺損修復(fù)，其在治療心肌缺血和神經(jīng)退行性病變的應(yīng)用也進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段。ADSCs的生物學(xué)特性是影響干細(xì)胞治療成敗的關(guān)鍵因素之一。隨年齡增加，細(xì)胞發(fā)生自然老化，而且已

2、有研究證實(shí)年齡因素會影響機(jī)體多種干細(xì)胞的生物學(xué)功能。那么，ADSCs是否隨供者年齡增加而發(fā)生老化，從而導(dǎo)致其增殖、分化、遷移等生物學(xué)特性改變而最終影響修復(fù)功能還缺乏深入研究。
　　研究目的:
　　明確不同年齡段人脂肪組織中間充質(zhì)干細(xì)胞含量和老化程度的差異，及其表現(xiàn)在增殖、分化、遷移等生物學(xué)特性上的改變，為深入了解年齡因素對干細(xì)胞特性的影響及機(jī)制提供更豐富的信息，為不同年齡人群自體ADSCs的臨床應(yīng)用提供有效參考。
　　

3、研究內(nèi)容及方法:
　　從臨床獲取24例人右肋緣皮下切取脂肪組織，按供者年齡分布情況，分為三組:(A)兒童組，年齡跨度6-12歲;(B)青年組，年齡跨度22-27歲;(C)老年組，年齡跨度60-73歲。通過酶消化法獲得hADSCs，擴(kuò)增至第三代(P3)用于實(shí)驗(yàn)檢測。采用One-way ANOVA及Tukey檢驗(yàn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多組定量資料的兩兩比較分析。具體研究內(nèi)容包括:
　　1.單位體積脂肪SVF含量及hADSCs純度檢測

4、r>　　膠原酶消化法獲得脂肪組織中有核細(xì)胞作為基質(zhì)血管成分(Stromal VascularFraction，SVF)，比較三組單位體積脂肪中的SVF含量差別;SVF貼壁培養(yǎng)獲得hADSCs，流式分析P3代hADSCs干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)情況，比較三組符合干細(xì)胞表面標(biāo)志表達(dá)要求的hADSCs比例。
　　2.細(xì)胞老化程度及相關(guān)機(jī)制檢測
　　通過SA-β-Gal染色對各年齡組P5代hADSCs老化程度進(jìn)行評價(jià);利用MitoSOX

5、TM熒光染色檢測活細(xì)胞線粒體超氧化物含量;采用流式分析法檢測hADSCs過氧亞硝酸含量;利用Real-time PCR檢測hADSCs端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶hTERT、組蛋白去乙酰化酶SIRT1表達(dá)水平，探索不同年齡組hADSCs出現(xiàn)老化程度差異的機(jī)制。
　　3.細(xì)胞增殖及凋亡檢測
　　MTS法檢測各年齡組hADSCs增殖能力，并通過細(xì)胞周期分析及周期調(diào)控基因檢測探索其機(jī)制;利用Muse細(xì)胞狀態(tài)分析儀對細(xì)胞凋亡狀態(tài)進(jìn)行檢測。

6、　　4.細(xì)胞成脂成骨分化能力檢測
　　P3代hADSCs分別成脂成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，在不同時(shí)間點(diǎn)通過組化染色及Real-timePCR檢測成脂成骨分化關(guān)鍵表型標(biāo)志基因表達(dá)，明確不同年齡組hADSCs的多向分化能力的差異。
　　5.細(xì)胞遷移能力及其機(jī)制檢測
　　利用劃線法檢測無外源因子作用時(shí)hADSCs遷移能力;利用Transwell法檢測趨化因子作用下hADSCs的遷移能力。比較各年齡組hADSCs遷移能力的差異，并通過檢測

7、各年齡組hADSCs趨化因子受體CXCR4和CXCR7的表達(dá)水平探討其機(jī)制。
　　研究結(jié)果:
　　1.各年齡組單位體積脂肪SVF含量分別為:A組7.28×105±5.52×104個(gè)/ml、B組6.32×105±4.51×104個(gè)/ml、C組5.53×105±9.88×104個(gè)/ml，細(xì)胞存活率均在80％左右，三組間無顯著差異。P3代hADSCs均高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞陽性表面標(biāo)志物CD44、CD73、CD90、CD105，混合陰

8、性標(biāo)志物CD34、CD11b、CD19、CD45及HLA-DR的表達(dá)均低于5％，各年齡組符合間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)要求的hADSCs比例沒有顯著性差異。提示單純年齡因素不影響單位體積脂肪組織中SVF含量和擴(kuò)增中hADSCs的純度。
　　2.SA-β-Gal染色計(jì)數(shù)結(jié)果顯示老年組P5代hADSCs染色陽性細(xì)胞比例大于兒童組。進(jìn)一步用MitoSOXTM熒光染色檢測活細(xì)胞線粒體超氧化物表達(dá)，結(jié)果顯示兒童組和青年組樣本染色陰性，而老年

9、組樣本均呈陽性。流式細(xì)胞儀檢測hADSCs過氧亞硝酸含量，結(jié)果顯示隨年齡增長過氧亞硝酸含量有升高趨勢，老年組與兒童組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而且，老年組hADSCs的hTERT，SIRT1的表達(dá)水平較兒童組和青年組有下降趨勢。以上結(jié)果提示老年組hADSCs老化程度更高。
　　3.細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨供者年齡增長，hADSCs增殖速率有減慢趨勢，但各組間無顯著差異。從細(xì)胞周期角度分析發(fā)現(xiàn)，老年組hADSCs處于S期的細(xì)胞比例較其他兩組顯著降

10、低，原癌基因c-Jun、c-Fos表達(dá)也有降低趨勢，且周期素依賴激酶抑制基因P21表達(dá)顯著增高，提示老年組hADSCs可能發(fā)生了細(xì)胞周期阻滯，由G1期進(jìn)入S期速率減慢。各年齡組hADSCs細(xì)胞凋亡分布狀態(tài)及凋亡調(diào)控基因Bcl-2、 NFκB、caspase8的表達(dá)水平無顯著差異。上述結(jié)果提示隨年齡增長，hADSCs的細(xì)胞周期發(fā)生改變，從而影響其增殖潛能。
　　4.hADSCs成脂誘導(dǎo)早期(D4)，兒童組成脂相關(guān)基因CEBPα、PP

11、ARγ、adiponectin、LPL、FABP4的表達(dá)顯著高于青年組和老年組，但誘導(dǎo)中晚期(D8，D12)差異消失。油紅O染色及半定量分析顯示三組在誘導(dǎo)不同時(shí)間點(diǎn)甘油三酯生成量無顯著差異。而且成脂酶相關(guān)基因及能量代謝基因的表達(dá)在各組間無顯著性差異。提示年齡因素對hADSCs的成脂分化潛能無顯著影響。
　　hADSCs成骨誘導(dǎo)早期(D7)，老年組成骨相關(guān)基因RUNX2、OCN、OPN、BMP2的表達(dá)水平既顯著低于兒童組。至誘導(dǎo)晚期

12、(D21)，茜素紅染色半定量檢測顯示老年組成骨誘導(dǎo)礦化水平顯著低于兒童組，且礦化基因OPN的表達(dá)顯著低于兒童組。提示老年供者h(yuǎn)ADSCs的成骨分化能力較兒童組顯著降低。
　　5.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示老年組hADSCs細(xì)胞遷移能力顯著低于兒童組，進(jìn)一步研究顯示老年組hADSCs趨化因子受體CXCR4和CXCR7的表達(dá)水平較兒童組有降低趨勢，提示趨化因子受體表達(dá)降低可能是其遷移能力下降的原因之一。
　　研究結(jié)論:
　　1.

13、年齡因素對胸部皮下單位體積脂肪SVF含量及擴(kuò)增的hADSCs純度無顯著影響。
　　2.年齡因素影響hADSCs的老化程度:老年個(gè)體hADSCs老化程度更高，細(xì)胞內(nèi)ROS含量升高導(dǎo)致氧化應(yīng)激加強(qiáng)可能是其發(fā)生機(jī)制之一。
　　3.年齡因素影響hADSCs的增殖能力:老年個(gè)體hADSCs出現(xiàn)增殖減緩的趨勢，可能與老年組hADSCs發(fā)生周期阻滯有關(guān)。
　　4.年齡因素影響hADSCs的分化潛能:老年個(gè)體hADSCs的體外成脂分化

14、潛能無顯著變化，但成骨分化潛能降低，提示老年患者自體hADSCs用于成骨相關(guān)治療的可行性降低。
　　5.年齡因素影響hADSCs的遷移能力:老年組hADSCs遷移能力降低，其表面趨化因子受體CXCR4和CXCR7表達(dá)水平下降可能是其原因之一。
　　綜上，年齡因素對胸部切取單位體積脂肪SVF含量沒有顯著影響;但隨年齡增長，hADSCs老化程度更高，表現(xiàn)出增殖、分化及遷移能力的相應(yīng)降低。本研究不僅檢測了干細(xì)胞生物學(xué)表現(xiàn)的變化，而