干細(xì)胞的體外培養(yǎng)概述

1、干細(xì)胞的體外培養(yǎng),,一、干細(xì)胞的概念,干細(xì)胞(stem cells, SC)是一類具有自我復(fù)制能力(self-renewing)的多潛能細(xì)胞，在一定條件下，它可以分化成多種功能細(xì)胞。干細(xì)胞是一種未充分分化，尚不成熟的細(xì)胞，具有再生各種組織器官和人體的潛在功能，醫(yī)學(xué)界稱之為“萬用細(xì)胞”。,干細(xì)胞幾個主要特征,具有自我更新能力與自我維持能力，可以無限增殖分裂。干細(xì)胞一旦形成，在機體內(nèi)終生都具有自我更新能力，以維持自身數(shù)目的恒定。既具有生

2、理性的更新能力，也具有對損傷或疾病導(dǎo)致的反應(yīng)有修復(fù)能力，如骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞等。 干細(xì)胞維持自穩(wěn)性的機制：對稱分裂和不對稱分裂,,,4,干細(xì)胞的對稱分裂和不對稱分裂,對稱分裂 （symmetry division）,不對稱分裂 （asymmetry division）,干細(xì)胞 分 化 細(xì) 胞,,干細(xì)胞 分化細(xì)胞,干細(xì)胞幾個主要特征,干細(xì)胞本身不是終末分化細(xì)胞；具有多向分化的能力（多能性或全能性），

3、即可以分化發(fā)育成各種胚層組織的細(xì)胞（ES細(xì)胞），或可以分化成為本系統(tǒng)各譜系的細(xì)胞（特定組織干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞）。,干細(xì)胞幾個主要特征,干細(xì)胞的自我更新與分化需要特定的微環(huán)境，也就是說干細(xì)胞往哪一種方向分化，必須在該細(xì)胞生存的特定微環(huán)境前提下進行分化。已有諸多的實驗表明，如將ES細(xì)胞種植入小鼠大腦內(nèi)，這些干細(xì)胞將向神經(jīng)系統(tǒng)分化。,在不同生長因子刺激下干細(xì)胞可表現(xiàn)出不同分化潛能,干細(xì)胞幾個主要特征,干細(xì)胞分裂產(chǎn)生的子細(xì)胞只能有兩種命運——

4、保持為干細(xì)胞或分化為特定細(xì)胞。,二、干細(xì)胞的分類,1、按分化潛能大小來分類:全能干細(xì)胞（ Totipotent stem cell ）：能分化成所有組織和器官的干細(xì)胞，它具有形成完整個體的分化潛能。如受精卵，胚胎干細(xì)胞。多能干細(xì)胞（ pluripotent stem cell ），具有分化出多種組 織細(xì)胞的潛能，但卻失去了發(fā)育成完整個體的能力，發(fā)育 潛能受到一定的限制。如骨髓多能造血干細(xì)胞是典型的例 子，它

5、可分化出至少十二種血細(xì)胞 。專能干細(xì)胞（ unipotent stem cell ），這類干細(xì)胞只能向 一種類型或密切相關(guān)的兩種類型的細(xì)胞分化，如上皮組織 基底層干細(xì)胞、肌肉中的成肌細(xì)胞等。,2、根據(jù)來源來分: 來源于胚胎--- 胚胎干細(xì)胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖細(xì)胞 EGC

6、 （Embryonic Germ Cell ） 來源于成體組織--- 成體干細(xì)胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）,,胚胎干細(xì)胞,指從著床前的胚胎內(nèi)細(xì)胞團（桑椹胚）或原始生殖細(xì)胞獲得的一種具有多潛能性、可發(fā)育成為各種細(xì)胞、同時可保持不分化狀態(tài)而持續(xù)生長的克隆細(xì)胞系。它可以無限增殖并分化成為全身200多種細(xì)胞類型，進一步形成機體的所有組織、器官。為全

7、能干細(xì)胞。,成體干細(xì)胞,是成體組織內(nèi)具有自我更新及分化一種或一種以上子細(xì)胞的未成熟細(xì)胞。來源于成年組織或器官，一般具有組織特異性，只能分化成特定的細(xì)胞或組織。為多能干細(xì)胞或單能干細(xì)胞，如造血干細(xì)胞和上皮干細(xì)胞等。,3、根據(jù)干細(xì)胞組織發(fā)生的名稱進行分類:,胎胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞骨髓間質(zhì)干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞成骨干細(xì)胞內(nèi)胚層干細(xì)胞視網(wǎng)膜干細(xì)胞胰腺干細(xì)胞,三、干細(xì)胞研究的歷史情況,1959年，美國首次報道了通過體外受精（IVF）動物

8、。 60年代，幾個近親種系的小鼠睪丸畸胎瘤的研究表明其來源于胚胎生殖細(xì)胞（embryonic germ cells, EG細(xì)胞）,此工作確立了胚胎癌細(xì)胞（embryonic carcinoma cells, EC細(xì)胞）是一種干細(xì)胞。 1968年，Edwards 和Bavister 在體外獲得了第一個人卵子。 70年代，EC細(xì)胞注入小鼠胚泡產(chǎn)生雜合小鼠。培養(yǎng)的EC細(xì)胞作為胚胎發(fā)育的模型，雖然其染色體的數(shù)目屬于異常。1978年，第一

9、個試管嬰兒在英國誕生。,1981年，從小鼠胚泡內(nèi)細(xì)胞團分離出小鼠ES細(xì)胞，并建立了小鼠ES細(xì)胞體外培養(yǎng)條件。將ES細(xì)胞注入小鼠，能誘導(dǎo)形成畸胎瘤。 1984-1988年，Anderews 等人從人睪丸畸胎瘤細(xì)胞系Tera-2中產(chǎn)生出多能的、可鑒定的（克隆化的）細(xì)胞，稱之為胚胎癌細(xì)胞（embryonic carcinoma cells, EC細(xì)胞）?？寺〉娜薊C細(xì)胞在視黃酸的作用下分化形成神經(jīng)元樣細(xì)胞和其他類型的細(xì)胞。 1989年，P

10、era 等分離了一個人EC細(xì)胞系，此細(xì)胞系能產(chǎn)生出三個胚層的組織。這些細(xì)胞是非整倍體的（比正常細(xì)胞染色體多或少），他們在體外的分化潛能是有限的。,1998年美國有兩個小組分別培養(yǎng)出了人的多能干細(xì)胞： James A. Thomson在 Wisconsin大學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的研究小組的方法是：人卵體外受精后，將胚胎培育到囊胚階段，提取 inner cell mass細(xì)胞，建立細(xì)胞株。 John D. Gearhart在 Johns Hopkins大

11、學(xué)領(lǐng)導(dǎo)的另一個研究小組的方法是：從受精后5－9周人工流產(chǎn)的胚胎中提取生殖母細(xì)胞( primordial germ cell )，建立細(xì)胞株。1999年12月，美國科學(xué)家在《美國科學(xué)院院刊》報告說，小鼠肌肉組織的成體干細(xì)胞可以“橫向分化”為血液細(xì)胞。隨后，世界各國的科學(xué)家相繼證實，成體干細(xì)胞，包括人類的成體干細(xì)胞具有可塑性。1999年12月，干細(xì)胞研究進展被《科學(xué)》雜志評選為該年度世界十大科學(xué)進展之首。2007年日本的Yamanak

12、a研究小組和美國的James Thomson 研究小組分別獲得誘導(dǎo)多能性干細(xì)胞 （induced pluripotent stem cell，iPS細(xì)胞）。,,至今已分離得到的胚胎干細(xì)胞物種有：小鼠的胚胎干細(xì)胞（1981）金黃地鼠（1988）、貂（1993）、豬（1994，1997）、雞（1996）、恒河猴（1995）、絨猴（1996）。分離得到人的胚胎干細(xì)胞（1998），胚胎生殖細(xì)胞（1998），目前不斷報道成年組織來源的的

13、干細(xì)胞。,四、胚胎干細(xì)胞的體外培養(yǎng),（一）技術(shù)原理基本原則：促進ES增殖的同時，維持其未分化的二倍體狀態(tài)。有飼養(yǎng)層（feeder layer）培養(yǎng)法：以小鼠成纖維細(xì)胞耐硫代鳥嘌呤和耐烏苯苷亞系（STO）或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（ Mouse Embryo Firbroblasts, MEF）制備飼養(yǎng)細(xì)胞單層，主要是利用其分泌的生長因子FGF和抑制干細(xì)胞分化因子白血病抑制因子（LIF）共同作用，保持干細(xì)胞在體外克隆而不分化。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)

14、法：利用各種能分泌抑制分化因子的細(xì)胞制備條件培養(yǎng)基或在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入重組的LIF制備條件培養(yǎng)基。,（二）基本過程,飼養(yǎng)層細(xì)胞制備或條件培養(yǎng)基制備,胚胎的制備和培養(yǎng),胚胎干細(xì)胞的分離,胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng),胚胎干細(xì)胞的鑒定,凍存與復(fù)蘇,,,,細(xì)胞克隆形態(tài),堿性磷酸酶檢測,核型的鑒定,分化能力的觀察,嵌合能力的測定,,,,,,,,,,,,1、飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng),小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（ MEF）：取孕12.5-14.5 d鼠胚胎軀干，以植塊培養(yǎng)法或分

15、散細(xì)胞培養(yǎng)法制備，取第三代至第五代細(xì)胞作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。STO細(xì)胞：按照一般已建細(xì)胞系培養(yǎng)方法。DMEM加10%小牛血清作為培養(yǎng)液。采用胎數(shù)多小鼠一次大量培養(yǎng)MEF凍存，用時復(fù)蘇。,MEF和STO的優(yōu)缺點：MEF分泌促進胚胎干細(xì)胞增殖和抑制分化因子的能力比STO強，STO作飼養(yǎng)細(xì)胞時常需在培養(yǎng)基中加入LIF。MEF不能長期傳代，需經(jīng)常準(zhǔn)備懷孕小鼠制備第三代至第五代細(xì)胞，STO則可長期傳代培養(yǎng)。MEF不具耐藥性，不能作為轉(zhuǎn)染外

16、源性基因的胚胎干細(xì)胞篩選用。SNL細(xì)胞為轉(zhuǎn)染了neor抗性基因和LIF基因的STO細(xì)胞，可分泌足夠的抑制分化因子，并因帶有neor抗性基因可用于轉(zhuǎn)基因胚胎干細(xì)胞篩選。胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，死亡MEF或STO的染色體可能導(dǎo)致胚胎干細(xì)胞的突變及影響正常核型的保持。不易獲得純的胚胎干細(xì)胞作為生化和分子生物學(xué)方面的分析。使用前如用絲裂霉素C處理，如清洗不徹底，殘余的絲裂霉素C會影響胚胎干細(xì)胞的增殖。,報道的人源性滋養(yǎng)層細(xì)胞：,人骨髓來源

17、的間充質(zhì)干細(xì)胞胎兒肌肉或胎兒皮膚細(xì)胞新生兒包皮成纖維細(xì)胞成人子宮內(nèi)膜細(xì)胞人胎盤成纖維細(xì)胞人胚胎干細(xì)胞經(jīng)體內(nèi)分化獲取的間充質(zhì)干細(xì)胞,2、飼養(yǎng)單層制備,MEF或STO連成一片，以含10μg/ml絲裂霉素培養(yǎng)液370C作用2-3 h（如細(xì)胞層較薄，也可縮短至30min-1.5h），或γ射線照射（劑量為30-100Gy）。棄含絲裂霉素培養(yǎng)液，PBS洗5次， γ射線處理者不用清洗。消化細(xì)胞，制備懸液種植至用0.1%明膠處理過（0

18、.1%明膠水溶液覆蓋培養(yǎng)瓶表面，室溫2h以上）的培養(yǎng)瓶，種植細(xì)胞數(shù)：MEF7.5×104-105個/cm2，STO為5×104個/cm2。培養(yǎng)至細(xì)胞連成一片沒有間隙（中間可補加處理過的細(xì)胞），制備好的飼養(yǎng)單層置培養(yǎng)箱，5天內(nèi)使用，使用前換成干細(xì)胞培養(yǎng)液。,,,,觀察：好的飼養(yǎng)單層，細(xì)胞連成一片，無間隙，死亡細(xì)胞和雜細(xì)胞極少。MEF和STO產(chǎn)生的抑制分化因子一部分分泌到培養(yǎng)液中，一部分錨定在細(xì)胞外基質(zhì)上。無間隙

19、的飼養(yǎng)單層保證了胚胎干細(xì)胞都能與飼養(yǎng)層細(xì)胞接觸而達到最佳效果。,3、用于培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞的條件培養(yǎng)基,直接在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液中加入重組的LIF，使終濃度為1000U/ml。Baffalo大鼠肝細(xì)胞株BRL條件培養(yǎng)基（BRL-CM):能分泌抑制畸胎癌（瘤）和胚胎干細(xì)胞分化的因子DIF。收集培養(yǎng)72h的培養(yǎng)液，過濾除菌，用前6-7份+3-4份胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液，再添加8-10%胎牛血清。年齡 2-3周大鼠心肌細(xì)胞條件培養(yǎng)基（RH-CM）：分

20、泌抑制胚胎干細(xì)胞分化因子。收集1-6代細(xì)胞培養(yǎng)液，過濾除菌，用前6份+3份胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液+1份胎牛血清。,4、胚胎干細(xì)胞的分離和培養(yǎng),（1）培養(yǎng)液配制培養(yǎng)液要用超純水或五蒸水，不能有細(xì)菌內(nèi)毒素污染，水要現(xiàn)用現(xiàn)制。高糖DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，葡萄糖濃度為（4.5g/L）：有助于囊胚貼壁、內(nèi)細(xì)胞團增殖及胚胎干細(xì)胞集落形成。使用前還要添加β-巰基乙醇（0.1mmol/L）或單硫甘油（ 0.15mmol/L）：保護細(xì)胞內(nèi)酶和蛋白質(zhì)中的巰

21、基不被氧化，促進胚胎干細(xì)胞的貼壁和克隆形成。使用前要添加15%胎牛血清：必不可少，但也有缺點。,血清缺點：成分復(fù)雜，不利于整合到胚胎干細(xì)胞基因組中外源性基因功能的測定；可能含有一些未知的促進胚胎干細(xì)胞分化的因子；含有微量的血紅蛋白和內(nèi)毒素，干擾胚胎干細(xì)胞生長。無血清胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液無上述缺點，但細(xì)胞貼附力不如有血清培養(yǎng)基。,,（2）胚胎干細(xì)胞的分離,小鼠：母小鼠超數(shù)排卵交配（注射孕馬血清促性腺激素和人絨毛膜促性腺激素）胚

22、胎采集：取孕3.5d（囊胚期或桑椹期）的母小鼠取胚胎胚胎培養(yǎng)：培養(yǎng)皿內(nèi)制備直徑0.5cm左右露滴狀培養(yǎng)液液滴，并覆蓋透明石蠟油，胚胎置于液滴中培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞分離：普通分離法、免疫外科法，棄除滋胚層細(xì)胞，獲得內(nèi)細(xì)胞團（inner cell mass，ICM），并分散為3-4個細(xì)胞在一起的細(xì)胞團,,,,人胚胎干細(xì)胞來源,a.自終止妊娠（5-9周人工流產(chǎn)）的胎兒中提取生殖母細(xì)胞( primordial germ cell )。,,28

23、,Gearhart法,,29,b.取自體外受精胚胎囊胚期內(nèi)層細(xì)胞。用這種方法，每個胚胎可取得15－20個細(xì)胞用于培養(yǎng)。,Thomson法,c.通過體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移技術(shù)（SCNT技術(shù)）獲取,,30,,其它干細(xì)胞的分離與純化,干細(xì)胞表面有許多特殊的標(biāo)記，以造血系統(tǒng)為例，干細(xì)胞的表面標(biāo)志有Sca-1和c-kit等。另外各種成體干細(xì)胞還有各自獨特的標(biāo)記物，如人造血干細(xì)胞表現(xiàn)為CD34+和Thy10+而CD10，CD14，CD15，CD16，CD19

24、，CD20皆為陰性另外干細(xì)胞還有不同于一般分化細(xì)胞的物理特性，比如干細(xì)胞不被染料Hoechst33324和Rhodamine123染色。利用這些特性及表面標(biāo)志，采用熒光細(xì)胞分離器從單細(xì)胞懸液中即可分離純化干細(xì)胞。,（3）胚胎干細(xì)胞培養(yǎng),有飼養(yǎng)層細(xì)胞培養(yǎng)：將內(nèi)細(xì)胞團吸置處理過的飼養(yǎng)層上，一個內(nèi)細(xì)胞團放置一個孔，370C、5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)2d后出現(xiàn)小集落，并逐步增大，6-10d可消化傳代，消化時，消化30s后棄消化液，殘余消化

25、液繼續(xù)作用，當(dāng)飼養(yǎng)單層出現(xiàn)裂隙（或顯微鏡下細(xì)胞之間分開），終止消化，一般為2-3min加適量培養(yǎng)液，輕輕吹打成單細(xì)胞懸液，接種新飼養(yǎng)層擴大培養(yǎng)。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)：明膠包被培養(yǎng)板，條件培養(yǎng)基。已建系胚胎干細(xì)胞：將已培養(yǎng)2-3d生長旺盛干細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液，添加新的培養(yǎng)液，按照1：3或1：6比例轉(zhuǎn)鐘。,注意事項：最初分離的內(nèi)細(xì)胞團以3-4個細(xì)胞團為宜，但集落形成后，傳代過程中一定要消化成單細(xì)胞，否則胚胎干細(xì)胞會互相誘導(dǎo)，易于分化。培

26、養(yǎng)條件要始終如一。為了增強胚胎干細(xì)胞粘附力，除明膠包被外，還可以用纖維連接蛋白和多聚賴氨酸等促進粘附。,（4）培養(yǎng)結(jié)果,hES細(xì)胞集落（×10）,胚胎干細(xì)胞呈集落狀（島嶼狀）生長，邊緣整齊，表面平滑，結(jié)構(gòu)致密，隆起生長，細(xì)胞之間界限不清。消化成單細(xì)胞后細(xì)胞小而圓，核大，胞漿小。,A phase contrast image of the pluripotent murine embryonic germ cell,A cu

27、lture dish containing hundreds of colonies of murine embryonic germ cells. Each red-stained spot represents an individual colony comprised of hundreds or thousands of stem cells.,5、胚胎干細(xì)胞的凍存和復(fù)蘇,凍存液：胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液+10%-15%DMSO

28、。凍存細(xì)胞密度：106-107個/ml凍存與復(fù)蘇方法同普通細(xì)胞。LIF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞，仍然用不含LIF的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)液凍存。,（三）胚胎干細(xì)胞的鑒定,1、 ES細(xì)胞生物學(xué)特性（1）ES細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)及核型ES細(xì)胞具有與早期胚胎細(xì)胞相似的形態(tài)結(jié)構(gòu)，胞體體積小，核大，有一個或幾個核仁。細(xì)胞中多為常染色質(zhì)，胞質(zhì)結(jié)構(gòu)簡單，散布著大量核糖體和線粒體，核型正常，保留了二倍體性質(zhì)。正常ES細(xì)胞染色體正常，如發(fā)生異常則其很難發(fā)育分化形

29、成動物個體。,（2）ES細(xì)胞生長特性ES細(xì)胞在體外分化抑制培養(yǎng)中，呈克隆狀生長，細(xì)胞緊密地聚集在一起，形似鳥巢，細(xì)胞界限不清，克隆周圍有時可見單個ES細(xì)胞和分化的扁平狀上皮細(xì)胞。 ES細(xì)胞增殖迅速，每18—24 h分裂增殖 1次。此外，其還可以在體外進行選擇、操作、凍存。凍存的細(xì)胞可在需要時隨時解凍，繼續(xù)培養(yǎng)不失其原有特性，并且來自一個克隆的細(xì)胞具有同樣的特征。,,,40,人胚胎干細(xì)胞(hES)的特點,形態(tài)：圓形或橢圓，體積較小，

30、核質(zhì)比較大，體外抑制分化培養(yǎng)時呈鳥巢狀，集落生長并緊密堆積，細(xì)胞界限不明顯。,（3）ES細(xì)胞的高度分化潛能,ES細(xì)胞在體外需在飼養(yǎng)層細(xì)胞上培養(yǎng)才能維持其未分 化狀態(tài)，一旦脫離飼養(yǎng)層就自發(fā)地進行分化。在單層培養(yǎng)時細(xì)胞自發(fā)分化成多種細(xì)胞， 懸浮培養(yǎng)中： “簡單類胚體” ? “囊狀胚體” ? 細(xì)胞分化物。ES細(xì)胞可進行誘導(dǎo)分化 *用RA（維生素A酸或視黃酸）作誘導(dǎo)90％以上的ES細(xì)胞

31、 分化為神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞， *聚集培養(yǎng)的ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化則可分化為有節(jié)律性收縮 的心肌細(xì)胞。 *將ES細(xì)胞注射到同源動物皮下，可形成組織瘤，其細(xì)胞 組成可代表3個胚層細(xì)胞。 *用ES細(xì)胞作核供體進行細(xì)胞核移植，可以得到可發(fā)育重 構(gòu)胚和動物個體。,（4）堿性磷酸酶的表達,許多資料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚細(xì)胞和囊胚細(xì)胞均有堿性磷酸酶（AKP）表達，小鼠的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中均含有豐富的A

32、KP。而在已分化的EC細(xì)胞和ES細(xì)胞中AKP呈弱陽性或陰性。豬、兔的桑椹胚和早期囊胚AKP呈陽性。因此，AKP常用來作為鑒定EC細(xì)胞或ES細(xì)胞分化與否的標(biāo)志之一。,（5）胚胎階段特異性細(xì)胞表面抗原的表達,早期胚胎細(xì)胞表面均表達胚胎階段特異性表面抗原（SSEA-1）。在胚胎的原始外胚層細(xì)胞、ES細(xì)胞、EC細(xì)胞和原始生殖細(xì)胞的表面均可檢測到SSEA-1的表達。小鼠SSEA-1的表達自8細(xì)胞期開始，直到原始外胚層形成期。早期囊胚ICM細(xì)胞全部

33、呈強陽性，晚期囊胚中部分ICM呈強陽性，部分呈弱陽性，少部分為陰性。因此，SSEA也常作為ES細(xì)胞鑒定的一個標(biāo)志。,2、ES細(xì)胞的全能性主要體現(xiàn)在以下幾方面： ①形成畸胎瘤。將ES細(xì)胞注人同源動物皮下可形成畸胎瘤，包括三個胚層細(xì)胞； ②形成類胚體。培養(yǎng)ES細(xì)胞在非粘附底物中懸浮生長，或控制增殖細(xì)胞數(shù)目，能夠使之生成類胚體，它是一個與畸胎瘤相似的多種細(xì)胞系混雜的集合體、具有三個胚層組織；,③直系分化。通過控制ES細(xì)胞生長環(huán)境，

34、或遺傳操縱特定基因表達，ES細(xì)胞可直接分化成某特定種系細(xì)胞，例如將神經(jīng)決定基因NeuroD2和NeuroD3轉(zhuǎn)人ES細(xì)胞，可使之分化為神經(jīng)細(xì)胞； ④形成嵌合體。將ES細(xì)胞注射到同種動物囊胚腔中后，可以形成嵌合體（chimera），ES細(xì)胞可以參與嵌合體各個器官包括生殖腺的發(fā)育。這是檢驗一個細(xì)胞系是否為ES細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)。,3、ES細(xì)胞的鑒定,-- 細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)-- 核型分析-- 堿性磷酸酶（AKP）染色-- SSEA-I 免疫熒光

35、標(biāo)記-- 分化能力檢測 體外分化試驗 體內(nèi)分化試驗 嵌合體形成試驗 核移植試驗,（1）ES細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定 依ES細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)（胞體體積小，核大、有一個或幾個核仁）和生長特性（呈克隆狀生長，細(xì)胞緊密聚集，形似鳥巢，界限不清）對ES細(xì)胞進行初步鑒定。,（2）核型分析 ES細(xì)胞具

36、有正常二倍體核型，可用核型分析進行檢驗,（3）堿性磷酸酶（AKP）染色原理：AKP在堿性條件（pH9.0-9.6）下能使孵育液中的α-磷酸奈酚鈉水解，產(chǎn)生α-奈酚，然后再與偶氮鹽偶聯(lián)，形成不溶性染料而呈現(xiàn)顏色。步驟：生長胚胎干細(xì)胞克隆的蓋片以無水乙醇或冷丙酮固定10-15min→水洗→滴加孵育液室溫5-10min→水洗10min→復(fù)染（甲基綠等） 10min。結(jié)果：未分化胚胎干細(xì)胞顏色以所用偶氮鹽品種而異，分化者則為復(fù)染液顏色。

37、對照：以已建系ES細(xì)胞（或小鼠的脫帶桑椹胚或囊胚）作為陽性對照，作用液中不含α-萘酚磷酸鈉為陰性對照。,（4）胚胎干細(xì)胞特異表面抗原的表達,免疫熒光檢測SSEA胚胎階段特異性抗原:SSEA-1 SSEA-3 SSEA-4 Thmoson分離的hES 陰性 弱陽性 強陽性Gearhart分離的hES 陽性 弱陽性 陽性小鼠ES

38、 陽性 陰性 陰性鼠和人胚胎干細(xì)胞表達的表面抗原有種屬差異。RT-PCR檢測轉(zhuǎn)錄因子Oct-4的表達 Oct-4只限定在多潛能細(xì)胞中表達。人和小鼠的胚胎干細(xì)胞都表達轉(zhuǎn)錄因子Oct-4，當(dāng)胚胎干細(xì)胞分化時，其表達能力大大降低。,,,52,（5）分化能力檢測,體外分化能力觀察:無飼養(yǎng)層和無抑制分化因子的條件下培養(yǎng)，胚胎干細(xì)胞會分化成各種細(xì)胞或發(fā)育成胚胎體：3d “簡單類胚體” ? 5

39、-10d“囊狀胚體” ?貼壁細(xì)胞為細(xì)胞分化物。,體內(nèi)分化能力觀察：ES細(xì)胞接種同一品系小鼠腹股溝（107個細(xì)胞）或裸鼠、SCID小鼠（106個細(xì)胞）→約2周后出現(xiàn)腫塊，4-5周進一步增大，摘除腫塊→固定切片染色：見三個胚層組織，為畸胎瘤結(jié)構(gòu)裸鼠和SCID小鼠可接種異種細(xì)胞和組織的移植也可接種腹腔，2-3周后觀察腫瘤,嵌合能力測定：野灰色小鼠品系（如129鼠）ES注射白化體小鼠（BALB/c小鼠）或純合非野灰色小鼠（C57BL/6小鼠

40、）著床前胚胎內(nèi)，或?qū)碓从诎谆w小鼠的ES注射野灰色小鼠或純合非野灰色小鼠著床前胚胎內(nèi)，再移植到假孕母鼠子宮內(nèi)，使之發(fā)育成個體。 如ES具有嵌合能力，則會融合到宿主胚胎細(xì)胞中，并共同發(fā)育形成各種組織細(xì)胞并產(chǎn)生個體小鼠即為嵌合體，其毛色應(yīng)是ES細(xì)胞來源品系小鼠和胚胎供體小鼠毛色的雜合，即有白色皮毛也有野灰色或黑色皮毛。 除毛色觀察，也可檢測同工酶遺傳標(biāo)記，或采用PCR和小衛(wèi)星DNA方法等鑒定嵌合體。

41、,六、成體干細(xì)胞,優(yōu)點獲取相對容易 源于患者自身的成體干細(xì)胞在應(yīng)用時不存在組織相容性的問題，避免了移植排斥反應(yīng)和使用免疫抑制劑 理論上，成體干細(xì)胞致瘤風(fēng)險很低，而且所受倫理學(xué)爭議較少 成體干細(xì)胞還具有多向分化潛能,但胚胎干細(xì)胞也存在自身的優(yōu)勢： 胚胎干細(xì)胞能永生化，可以傳代建系，且增殖能力強，來源充沛。 雖然成體干細(xì)胞具有向多系分化的能力，但這種分化的“效率”尚不理想。通過體外的擴增培養(yǎng)能提高轉(zhuǎn)化效率，但是體外的轉(zhuǎn)化是否會引

42、起成體干細(xì)胞遺傳變化還有待證實，而且這種分化是否是成體干細(xì)胞多系分化的結(jié)果尚無法肯定。成體干細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞各有自身的優(yōu)勢和缺陷。同時開展對兩者的研究，能互為裨益，相得益彰。兩者的研究對干細(xì)胞領(lǐng)域而言都是必要的。,成體干細(xì)胞鑒定方法：科學(xué)家尚未就成體干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)達成一致，經(jīng)常被采用的鑒定方法包括： 利用分子標(biāo)記在活體組織中對細(xì)胞進行標(biāo)記，然后確定它們所產(chǎn)生的特定細(xì)胞類型。 將細(xì)胞從活體動物上分離出來，在對其進行細(xì)胞培養(yǎng)的過程

43、中進行標(biāo)記，之后將細(xì)胞移植入另一個動物體內(nèi)，觀察該細(xì)胞是否可以再生其來源組織。 分離細(xì)胞，進行細(xì)胞培養(yǎng)，并對其分化進行控制，通常采用加入生長因子或向細(xì)胞內(nèi)引入新基因的方法，進而觀察細(xì)胞的分化方向。,目前研究的成體干細(xì)胞 （Adult Stem Cells）Bone Marrow Heamatopoietic Stem Cells( HSC )Peripheral Blood Stem Cells ( PBSC )Fetal

44、Liver Stem CellsUmbilical Cord Blood Stem CellsNeural Stem Cells,,造血干細(xì)胞作為干細(xì)胞研究與應(yīng)用的突破口,1. 造血細(xì)胞是細(xì)胞增殖分化的最佳模型。2. 造血干／祖細(xì)胞及各系血細(xì)胞的表面標(biāo)志較為清 楚，細(xì)胞表型特征可進行定量分析，且可分選。3. 造血干細(xì)胞增殖及向各系分化的重要誘導(dǎo)因 子、受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、微環(huán)境等因素較為清楚。4. 造血細(xì)胞發(fā)揮功能

45、可相對游離，不需“生物支架”、 神經(jīng)、血管、外科移植等復(fù)雜的“下游”工藝，因 此便于直接應(yīng)用于臨床。,神經(jīng)干細(xì)胞(nural stem cell，NSC),NSC可增殖分化出中樞神經(jīng)系統(tǒng)的三種基本細(xì)胞：神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞。 神經(jīng)干細(xì)胞的生化標(biāo)記為巢素蛋白及波形蛋白。由于分離神經(jīng)干細(xì)胞所需的胎兒腦組織較難取材，神經(jīng)干細(xì)胞的研究仍處于初級階段。,五、目前干細(xì)胞的研究熱點,人體干細(xì)胞的建株；干細(xì)胞保持不分化的

46、培養(yǎng)；干細(xì)胞的定向誘導(dǎo)分化；干細(xì)胞應(yīng)用的法律、倫理道德問題；干細(xì)胞、組織工程、器官工程；胚胎組織的種植及定向誘導(dǎo)分化。,六、胚胎干細(xì)胞研究的應(yīng)用前景ES細(xì)胞在哺乳動物個體發(fā)生發(fā)育規(guī)律的研究中極有價值的工具；ES細(xì)胞是研究細(xì)胞分化的理想手段；ES細(xì)胞是研究基因功能的首選細(xì)胞；ES細(xì)胞作為生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物的主要途徑之一；ES細(xì)胞治療技術(shù)將引起一場醫(yī)學(xué)革命；ES細(xì)胞可用于研究細(xì)胞癌變機理和新藥物的篩選。,Human Dis

47、ease model,,藥物開發(fā)、毒性測試,臨床醫(yī)療應(yīng)用,基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究,,Human disease model,,胚胎干細(xì)胞的基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研發(fā)與臨床應(yīng)用,來源于干細(xì)胞的組織可能用于治療的疾病,細(xì)胞類型 治療的疾病神經(jīng)細(xì)胞 中風(fēng)、帕金森氏病、老年癡呆癥、 脊髓損傷、多發(fā)性硬化病心肌細(xì)胞 心臟病發(fā)作、充血性心臟病產(chǎn)生胰島素的細(xì)胞 糖尿

48、病軟骨細(xì)胞 骨性關(guān)節(jié)炎血細(xì)胞 免疫缺乏癥、血液病、白血病肝細(xì)胞肝炎、肝硬化皮膚細(xì)胞燒傷骨細(xì)胞骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)(眼)細(xì)胞黃斑癥骨骼肌細(xì)胞 肌肉萎縮癥,干細(xì)胞治療優(yōu)點明顯,低毒性（或無毒性），一次藥有效； 不需要完全了解疾病發(fā)病的確切機理； 還可能應(yīng)用自身干細(xì)胞移植，避免產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)。用干細(xì)胞治療疾病已不再只是設(shè)想。,革命性的機制

49、轉(zhuǎn)變,利用胚胎干細(xì)胞治療疾病有廣泛的應(yīng)用前景，但是干細(xì)胞應(yīng)用在歐美卻受到社會倫理學(xué)的制約，并且在實際應(yīng)用中還不能避免免疫排斥。因此橫向分化的發(fā)現(xiàn)在干細(xì)胞研究中具有革命性意義。它打破了用于臨床治療的干細(xì)胞只能來源于胚胎或受精卵的限制，為干細(xì)胞治療疾病提供了新途徑。人們可望從自體中分離出成體干細(xì)胞，在體外定向誘導(dǎo)分化為靶組織細(xì)胞并保持增殖能力，將這些細(xì)胞回輸入體內(nèi)，從而達到長期治療的目的。,體外制造人體器官：比如通過形成嵌合體，在嚴(yán)格的控制

50、下，使動物的某些器官來源于人體干細(xì)胞。這些來自人體干細(xì)胞的器官可應(yīng)用于臨床移植治療；造血干細(xì)胞移植是目前治愈白血病和某些遺傳性血液病的唯一希望，在腫瘤和難治性免疫疾病的治療中也有其獨特的作用。干細(xì)胞治療應(yīng)用于臨床任重而道遠(yuǎn)。,NIH關(guān)于胚胎干細(xì)胞研究的指導(dǎo)原則,允許　　1.從人胚中獲得新細(xì)胞系 　　2.使用私人資助、已經(jīng)獲得的來自人胚的細(xì)胞系進 行研究 3.從胎組織中獲得新細(xì)胞系 禁止

51、1.使用來自胎兒組織的細(xì)胞系進行研究 　　2.用干細(xì)胞創(chuàng)建人胚胎的研究 　　3.將人胚胎干細(xì)胞與動物胚胎結(jié)合的研究 　　4.使用干細(xì)胞進行生殖克隆 　　5.來自為研究目的而專門創(chuàng)建的胚胎的干細(xì)胞有關(guān)研究,去年考題,一、名詞解釋（每題3分，共30分） Contact inhibition；Nude mouse；NIH3T3；MTT test；Feeder Cells；Cell fusion；RPMI1640；Cloni

52、ng efficiency；PCD；In vivo culture,二、簡答題（每題6分，共30分）1．簡述HAT系統(tǒng)選擇雜交瘤細(xì)胞的原理。2．鏡下觀察組織培養(yǎng)細(xì)胞應(yīng)注意什么？對經(jīng)常出現(xiàn)的情況應(yīng)如何處理？3. 簡述一定濃度CO2對細(xì)胞培養(yǎng)的影響作用，應(yīng)用CO2培養(yǎng)箱的注意事項。 4. 簡述細(xì)胞轉(zhuǎn)化實驗中細(xì)胞選擇的原則、常用細(xì)胞及轉(zhuǎn)化因素 5．比較胰蛋白酶和膠原酶生物學(xué)活性的異同。,三、問答題（每題10分，共40分）1．試