胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的初步探討.pdf

1、目的：在前期課題組研究的基礎(chǔ)之上，優(yōu)化飼養(yǎng)層體系，穩(wěn)定培養(yǎng)條件，探索適合自身實(shí)驗(yàn)室條件的胚胎干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系，對實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的描述記錄實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。 方法： 1.使用胰酶消化法體外分離培養(yǎng)MEF，MTT法測定P3、P8和復(fù)蘇P3MEF生長活力，優(yōu)化原代取材、傳代、凍存和復(fù)蘇細(xì)胞的條件，免疫組化檢測MEF特異性標(biāo)志——波形蛋白的表達(dá)，使用絲裂霉素C處理MEF，建立飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系。 2.自然受孕法和超排卵法獲取昆

2、明小鼠3.5dpc胚胎，體外培養(yǎng)發(fā)育至囊胚，全胚培養(yǎng)法獲取ICM，在飼養(yǎng)層上增殖，然后離散ICM種于新鮮的飼養(yǎng)層上，觀察ESC集落的形成，探索ESC體外培養(yǎng)體系。 3.收集生殖中心IVF-ET后剩余無冷凍價值的胚胎，醫(yī)院倫理委員會討論通過，簽署患者知情同意書后用于體外培養(yǎng)，探索其體外培養(yǎng)條件。 4.依據(jù)《實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源的描述標(biāo)準(zhǔn)與管理規(guī)范》，整理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，對實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的描述記錄實(shí)行標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。 結(jié)果： 1

3、.使用胰酶消化法可從10～18dpc小鼠胚胎中獲取MEF，倒置顯微鏡下觀察，13～15dpc小鼠胚胎獲得的MEF質(zhì)量較佳；第五代之后MEF逐漸呈衰老相；MEF生長曲線顯示：在第3天時三組細(xì)胞均進(jìn)入對數(shù)增長期，P8組細(xì)胞的增殖速度明顯低于其他兩組(P<0.05)。SABC免疫組化染色鑒定MEF，90％以上細(xì)胞中間絲波形蛋白呈棕色顆?；蜃厣?，即為陽性。絲裂霉素C處理MEF，終濃度為10μg/ml，作用時間2h，實(shí)驗(yàn)顯示在抑制細(xì)胞有絲分裂

4、的同時又不引起大量細(xì)胞死亡。 2.自然受孕法每只昆明小鼠可獲取8～12個3.5dpc胚胎，質(zhì)量較好的胚胎在飼養(yǎng)層體系中可逐漸發(fā)育至囊胚擴(kuò)張期，自然從透明帶孵出，ICM附著于飼養(yǎng)層上快速增殖。 3.整理了近三年課題組培養(yǎng)和凍存實(shí)驗(yàn)細(xì)胞數(shù)據(jù)，制定了規(guī)范化的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞記錄表格，標(biāo)準(zhǔn)化了實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的描述。 結(jié)論： 1.優(yōu)化穩(wěn)定了飼養(yǎng)層培養(yǎng)體系并鑒定飼養(yǎng)層細(xì)胞。 2.初步探索了胚胎培養(yǎng)及ICM集落形成的條件。