棉羊精原干細胞的分離富集與體外培養(yǎng)研究.pdf

1、精原干細胞(spermatogonialstemcells，SSCs)是成年雄性動物曲細精管中唯一能進行終生自我更新的一類二倍體永生細胞群。精原干細胞首先能夠減數(shù)分裂后形成單倍體的生殖細胞，并且具有類似胚胎干細胞的發(fā)育多潛能性。對精原干細胞進行基因修飾后，能將外源基因穩(wěn)定遺傳到后代基因組中，所以精原干細胞是進行體外操作理想的干細胞群體。隨著小鼠精原干細胞培養(yǎng)和移植研究的不斷完善，為各種哺乳動物及人類精原干細胞培養(yǎng)體系的建立和移植提供了新

2、的思路和技術(shù)路線。大動物精原干細胞的體外長期培養(yǎng)尚未取得突破性進展，目前為止，除了牛精原干細胞曾培養(yǎng)一個月的報道之外，在其他動物的精原干細胞建系和長期培養(yǎng)成功的報道。本實驗以綿羊為研究對象，比較了不同月齡羔羊睪丸曲細精管中的精原干細胞的動態(tài)變化，在此基礎(chǔ)上選擇適齡綿羊，通過兩步酶消化分離并差異貼壁法富集精原干細胞，對精原干細胞的短期和長期培養(yǎng)進行了初步研究。
　　 一.綿羊精原干細胞增殖和分化相關(guān)基因的克隆測序
　　 本

3、研究對與綿羊睪丸細胞自我更新、增殖和分化相關(guān)的基因，即PLZF、SCF、c-Kit、PGP9.5、GFRα1、VASA和GATA4以及管家基因GAPDH和18S等進行了克隆、測序。結(jié)果顯示：SCF、c-Kit、18S和GAPDH等4個基因與已發(fā)表(Pubmed)的綿羊相關(guān)基因序列有同源性；而PLZF、PGP9.5、GFRα1、VASA和GATA4等5個基因未見有相關(guān)的序列，但與牛的相關(guān)基因有高度同源性。
　　 二.綿羊曲細精管中

4、精原干細胞動態(tài)變化的觀察
　　 本研究，將1-10個月齡的羔羊劃分為四個發(fā)育期，即一期(1-2個月齡)、二期(3-4個月齡)、三期(5-6個月齡)和四期(9-10個月齡)，以PLZF、PGP9.5、VASA和Vimentin分別作為精原干細胞(或性原細胞)、A型精原細胞、生殖細胞和支持細胞的標志基因，觀察曲細精管中精原干細胞的動態(tài)變化。
　　 1.不同月齡羔羊睪丸曲細精管中PLZF、PGP9.5、VASA和Vimenti

5、n的表達
　　 免疫組織化學實驗顯示，PLZF在一期的性原細胞的細胞核中表達，到二期在位于靠近基膜的部分精原細胞的核中表達，三期和四期，僅在靠基膜的部分精原細胞中表達；PGP9.5通常在一期的曲細精管中心區(qū)的細胞質(zhì)中有表達，之后逐漸從中心區(qū)遷移到基膜附近；VASA在一期的性原細胞的細胞質(zhì)中表達，到二期在位于靠近基膜的所有精原細胞和剛剛發(fā)生的精母細胞的細胞質(zhì)中都均有表達，發(fā)育到三、四期后，在精原細胞、精母細胞、長形精子細胞和精子中

6、都均有表達，而且VASA陽性細胞數(shù)量急劇上升；Vimentin主要表達在支持細胞的核周圍，強度跟著羔羊月齡的增加而增強，在生殖細胞中不表達，小部分間質(zhì)細胞和血管壁上呈微著色。
　　 根據(jù)以上情況對曲細精管中的不同類型細胞做了統(tǒng)計，結(jié)果是一期主要由支持細胞組成(93％)，性原細胞約占6.4％；到二期支持細胞下降為64％，精原干細胞增加至12.2％，同時觀察到A型精原細胞，約占19.8％；在三期和四期，生殖細胞含量明顯高于一二期(P

7、<0.05)，精原干細胞下降至4.6％和3.1％，同時支持細胞的含量也明顯的減少，分別為37.3％和17.9％，(P<0.05)。以上結(jié)果表明，前兩個發(fā)育期即4個月齡以下的羔羊睪丸曲細精管中精原干細胞含量相對多一些，便于分離提純。
　　 2.不同月齡羔羊睪丸曲細精管中PLZF-PGP9.5、VASA-Vimentin、PGP9.5-Vimentin和PIZF-VASA熒光雙染色結(jié)果
　　 PLZF-PGP9.5熒光雙染色

8、顯示：PLZF的陽性反應(yīng)主要發(fā)生在性原細胞和精原細胞的細胞核內(nèi)，同時這些細胞的細胞質(zhì)對PGP9.5染色呈陽性；在一期，絕大多數(shù)PGP9.5陽性細胞同時呈PLZF陽性，到了二期，部分PGP9.5陽性細胞中PLZF染色呈陰性，三期和四期，PGP9.5-PLZF雙陽性的細胞數(shù)目逐漸減少。VASA-Vimentim雙染色結(jié)果顯示：VASA染色發(fā)生在細胞質(zhì)內(nèi)，而Vimentin染色發(fā)生在核周圍；四個發(fā)育期的VASA陽性細胞均呈Vimentin陰性

9、，隨著月齡的增長VASA陽性細胞數(shù)量急劇增多，Vimentin陽性細胞的數(shù)目則相對穩(wěn)定。PGP9.5-Vimentin染色結(jié)果顯示：PGP9.5陽性細胞與Vimentin陽性細胞不吻合，PGP9.5陽性細胞成圓形或橢圓形，而Vimentin陽性細胞的形態(tài)則不規(guī)則。PLZF-VASA染色結(jié)果顯示：在一期的性原細胞中PLZF和VASA都呈陽性，到二期，部分VASA陽性細胞對PLZF呈陰性；三期和四期，VASA陽性細胞的數(shù)量急劇上升，而PLZ

10、F-VASA雙陽性的細胞數(shù)目明顯減少。以上結(jié)果與免疫組織化學處理結(jié)果基本一致，羔羊曲細精管內(nèi)的生殖細胞在兩個月齡之前尚處于性原細胞階段，之后逐漸分化為A型精原細胞和其它向終端分化的細胞，這表明最佳獲得精原干細胞的時期是兩個月齡以前。
　　 三.綿羊精原干細胞的分離與純化
　　 本研究利用兩步酶消化法從發(fā)育一到二期羔羊睪丸組織中分離細胞。結(jié)果是，在一期從1克睪丸組織中可分離出19.2±4.3×107細胞，但到了二期分離的細

11、胞數(shù)明顯減少，減至8.0±0.6×107細胞。
　　 分離后的細胞通過差異貼壁法進行富集，然后對剛分離后收集的細胞(未處理組)、經(jīng)過2個小時純化得到的細胞(2小時處理組)和18小時純化處理得到的細胞(18小時處理組)分別進行PLZF、VASA、Vimentin染色處理和PLZF-PGP9.5、VASA-Vimentin、PGP9.5-Vimentin和PLZF-VASA熒光雙染色，其結(jié)果是：①在一期PLZF陽性細胞的比例在2小時

12、處理組和18小時處理組分別為42.9±6.2％和75.1±4.0％，顯著高于未處理組的7.8±1.3％(P<0.05)；在二期，前兩個處理組分別為18.6±3.0和28.2±3.3％，仍顯著高于未處理組的3.1±0.6％(P<0.05)；涂片染色還顯示，PLZF陽性細胞呈現(xiàn)出較強和較弱兩種細胞類型，強陽性細胞的體積較小，弱陽性細胞的體積大；強陽性細胞比例在2小時后處理組明顯增加，但與18小時處理組沒有顯著差異。②VASA陽性細胞的比例在

13、一、二期2小時處理組和18小時處理組均顯著高于未處理組(P<0.05)，而Vimentin陽性細胞的比例則顯著低于未處理組(P<0.05)。③PLZF-PGP9.5雙陽性細胞比例在一期18小時處理組達75％以上。以上結(jié)果表明，在一期(2個月齡以前)睪丸組織中得到的性原細胞經(jīng)分離、純化后可以用于體外培養(yǎng)研究。
　　 四.綿羊精原干細胞的體外培養(yǎng)
　　 1.綿羊精原干細胞的體外短期培養(yǎng)和免疫細胞化學、熒光染色檢測
　　

14、 以Ⅰ型和Ⅱ型兩種睪丸混合細胞分別作為飼養(yǎng)層細胞，用DMEM/F12+10％FBS基礎(chǔ)培養(yǎng)液對純化后的性原細胞進行體外培養(yǎng)。然后利用免疫細胞化學、熒光染色技術(shù)鑒定精原干細胞。結(jié)果顯示，在兩種飼養(yǎng)層上，均可觀察到如下現(xiàn)象：性原細胞在培養(yǎng)到1-2天開始貼壁，3-4天后分裂增殖。先出現(xiàn)2-32細胞的鏈狀細胞或小細胞團，一周左右后形成細胞團。細胞團的分布均勻，大小比較一致，看不到細胞間隙，細胞增殖成融合狀，但Ⅰ型飼養(yǎng)層上的細胞團數(shù)目顯著高于Ⅱ

15、型飼養(yǎng)層上的細胞團數(shù)目。在培養(yǎng)10天左右時，長出較大的細胞團，形態(tài)為圓形鳥巢狀集落，中間隆起；體積較小時顏色較透明，增大后逐漸變得黯淡，邊緣的細胞呈放射狀生長；Ⅰ型飼養(yǎng)層上的細胞團的活力明顯大于Ⅱ型飼養(yǎng)層上的細胞團。
　　 免疫細胞化學結(jié)果顯示，培養(yǎng)十四天后的精原干細胞團和鏈狀細胞都顯示較強的PLZF陽性，而飼養(yǎng)層不著色。通過機械法分離精原干細胞團，然后進行短暫胰酶消化處理，再做細胞涂片進行免疫細胞化學和熒光染色。結(jié)果顯示，在Ⅰ

16、型飼養(yǎng)層的處理組，30％的細胞出現(xiàn)PLZF陽性；但在Ⅱ型飼養(yǎng)層的處理組，陽性細胞不到10％。在兩種處理組中，VASA陽性細胞的比例都在60％左右，說明經(jīng)短期培養(yǎng)后部分細胞可能開始分化。是否血清中的不明成分導(dǎo)致精原干細胞分化，有待進一步探索。
　　 PLZF-VASA熒光雙染色結(jié)果顯示，精原干細胞團里包含PLZF和VASA雙陽性的細胞，而在VASA-Vimentin雙染色中，幾乎看不到Vimentin陽性細胞，絕大多數(shù)為VASA陽

17、性細胞，表明精原干細胞團可能不包含支持細胞和間質(zhì)細胞。
　　 2.綿羊精原干細胞的無飼養(yǎng)層長期培養(yǎng)和RT-PCR檢測
　　 通過降低血清濃度，同時添加B27和生長因子GDNF、LIF和βFGF，在鋪有0.2％明膠的35mm培養(yǎng)皿里無飼養(yǎng)層長期培養(yǎng)綿羊精原干細胞。其結(jié)果3天后出現(xiàn)4到8細胞的鏈狀細胞，第5天后鏈狀細胞的數(shù)量急劇上升，出現(xiàn)32個細胞的鏈狀細胞，但絕大多數(shù)細胞不貼壁增長。傳代后大部分細胞開始貼壁，而且干細胞團數(shù)