新生牛精原干細(xì)胞體外增殖調(diào)控的研究.pdf

1、精原干細(xì)胞(spermatogonial stem cell)是雄性動物生殖腺內(nèi)的一群具有高度自我更新能力和多向分化潛能，能向子代傳遞遺傳信息的細(xì)胞。由于精原干細(xì)胞在醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)基因動物研究等方面有著廣闊的應(yīng)用前景，近年來已經(jīng)成為眾多學(xué)者研究的熱點。但是精原干細(xì)胞在體外很難長期維持，這成為進(jìn)一步研究的障礙。本研究通過分離、純化及鑒定新生牛精原干細(xì)胞，對其體外培養(yǎng)體系進(jìn)行了優(yōu)化，并且導(dǎo)入人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomeras

2、e reverse transcriptase,hTERT)基因，以期促進(jìn)增殖，延長其在體外的細(xì)胞壽命。研究獲得如下結(jié)果： 1．通過兩步酶消化法分離獲得的新生牛睪丸細(xì)胞平均存活率為89.00％，精原干細(xì)胞比率為21.61％，細(xì)胞貼壁率為23.34％。 2．分離的新生牛睪丸細(xì)胞經(jīng)過Percoll密度梯度離心純化，結(jié)果顯示：精原干細(xì)胞主要分布在27％～35％Percoll梯度中，純度可達(dá)69.27％。 3．新生牛精原

3、干細(xì)胞集落細(xì)胞化學(xué)和免疫組化鑒定表明：堿性磷酸酶表達(dá)呈弱陽性，Integrinβ1和C-kit表達(dá)呈陽性；RT-PCR鑒定表明：新生牛精原干細(xì)胞表達(dá)精原干細(xì)胞特異基因gfrα1和c-kit。 4．通過優(yōu)化新生牛精原干細(xì)胞體外培養(yǎng)體系表明：在培養(yǎng)基中添加2.5％FBS，10μg/L LIF、20μg/L SCF、80μg/L GDNF以及支持細(xì)胞以5.0×10<'5>個/mL密度接種作為飼養(yǎng)層時，能顯著促進(jìn)精原干細(xì)胞增殖。

4、 5．新生牛精原干細(xì)胞通過脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染pCl-Neo-hTERT載體，600 μg/mL G418篩選獲得陽性細(xì)胞。端粒酶活性檢測顯示：該陽性細(xì)胞OD<,450/630>是未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的4倍；生長曲線表明：該陽性細(xì)胞在體外的群體倍增時間縮短了1.9倍。 以上結(jié)果證明，兩步酶消化法結(jié)合Percoll密度梯度離心分離純化新生牛精原干細(xì)胞能滿足進(jìn)一步研究的需要；通過優(yōu)化培養(yǎng)體系和轉(zhuǎn)染hTERT基因能顯著促進(jìn)新生牛精原干細(xì)胞在體外的增殖。