豬卵原干細(xì)胞體外分離、建系及其功能研究.pdf

1、我們采取初情期的內(nèi)蒙古白豬卵巢，用膠原酶對(duì)皮質(zhì)組織消化處理，制備卵巢皮質(zhì)組織單細(xì)胞懸液，再通過差速貼壁和抗體-磁珠分選法結(jié)合的方法富集卵原干細(xì)胞。在本實(shí)驗(yàn)中，我們采用的分選靶蛋白為Fragilis，最后將富含卵原干細(xì)胞的細(xì)胞懸液置于含有血清、EGF、BFGF、LIF的培養(yǎng)液中，在38.5℃、5％CO2的環(huán)境下培養(yǎng)，并對(duì)獲得的卵原干細(xì)胞進(jìn)行生物學(xué)特性驗(yàn)證。
　　在培養(yǎng)5-7天后，出現(xiàn)卵原干細(xì)胞克隆，以后每隔2-3天傳代一次，現(xiàn)在該細(xì)

2、胞系在體外已經(jīng)傳代56代，豬卵原干細(xì)胞的克隆細(xì)胞與小鼠卵原干細(xì)胞的形態(tài)相似，細(xì)胞界限清晰，核質(zhì)比大，體外傳代次數(shù)超過6代后，小部分的卵原干細(xì)胞開始自發(fā)分化，細(xì)胞的體積增大，其直徑可達(dá)60μm，形成卵母細(xì)胞樣細(xì)胞，并且在卵母細(xì)胞樣細(xì)胞外周形成透明帶樣結(jié)構(gòu)，免疫熒光分析顯示該結(jié)構(gòu)與ZP3蛋白的抗體特異結(jié)合，免疫熒光染色顯示這類細(xì)胞表達(dá)Scp3蛋白，表明這些卵母細(xì)胞樣細(xì)胞處于減數(shù)分裂期。經(jīng)免疫熒光檢測、RT-PCR基因表達(dá)分析結(jié)果顯示豬卵原干