小鼠卵母細(xì)胞干細(xì)胞體外分離、建系及其功能研究.pdf

1、最近，在小鼠和人的卵巢中發(fā)現(xiàn)卵母細(xì)胞干細(xì)胞，挑戰(zhàn)了長達(dá)半個多世紀(jì)的卵巢生物學(xué)中心法則，即:雌性哺乳動物出生后，其卵巢所儲存的卵泡數(shù)量是固定的，不再產(chǎn)生新的卵泡。這一生殖生物學(xué)新發(fā)現(xiàn)迫使我們重新認(rèn)識卵泡的發(fā)生和卵巢的功能。但是，從首次報道分離卵母細(xì)胞干細(xì)胞后，至今沒有見到進(jìn)一步的有關(guān)卵母細(xì)胞干細(xì)胞的報道，而且，后續(xù)的報道與以前的報道也不完全一致。因此，在該研究中，我們首先按照發(fā)表的方法分離小鼠的卵母細(xì)胞干細(xì)胞，在此基礎(chǔ)上，我們優(yōu)化了小鼠卵

2、母細(xì)胞干細(xì)胞分離的方法，并對建立的卵母細(xì)胞干細(xì)胞進(jìn)行各種鑒定和分析。
　　在本實驗中，我們首先采用磁珠分選方法從出生2周齡左右的乳鼠卵巢內(nèi)分離、純化表達(dá)細(xì)胞表面有DDX4蛋白的卵巢細(xì)胞，分離純化后獲得細(xì)胞系4株，將其中的兩株在體外培養(yǎng)傳代30代以上，染色體核型分析顯示細(xì)胞系無染色體丟失，染色體條數(shù)為40條(38+XX)。4株細(xì)胞系堿性磷酸酶染色均呈陽性，但是，隨著細(xì)胞代數(shù)增加，堿性磷酸酶染色變淺，在第9代后，堿性磷酸酶的染色基本穩(wěn)

3、定。細(xì)胞免疫熒光染色證明這類細(xì)胞均表達(dá)Oct4、DDX4、C-kit、Nanog等生殖干細(xì)胞標(biāo)記蛋白，采用RT-PCR基因表達(dá)分析進(jìn)一步證明這些細(xì)胞的確表達(dá)有Oct4、DDX4、C-kit、Blimp1、Ifitm3等生殖干細(xì)胞標(biāo)志基因。在本研究中我們簡化了分離卵母細(xì)胞干細(xì)胞方法，采用了連續(xù)貼壁法首先富集了卵母細(xì)胞干細(xì)胞，簡化了整個實驗過程，提高了分離方法的重復(fù)性。經(jīng)體外和體內(nèi)實驗手段對卵母細(xì)胞干細(xì)胞的發(fā)育潛能進(jìn)行分析和鑒定，我們成功在