牛雄性生殖系干細胞體外誘導分化及冷凍保存技術的研究.pdf

1、雄性生殖系干細胞是一群具有高度自我更新能力和分化潛能的細胞，它能向子代傳遞遺傳信息，是雄性成體內唯一可復制的二倍體永生細胞。轉基因技術與雄性生殖系干細胞異體及異種移植技術相結合，將會為克隆動物、轉基因動物生產及一些人類遺傳性疾病的基因治療提供新的機遇與途徑，在醫(yī)學、畜牧業(yè)生產等領域有著廣闊的應用前景。本試驗采用組合酶消化和選擇貼壁法，對5月齡、6月齡牛胎兒及新生牛雄性生殖系干細胞分離、培養(yǎng)及冷凍保存進行了研究，以期為后續(xù)轉基因動物研究提

2、供依據，結果如下： 1．牛睪丸支持細胞分離純化后進行體外培養(yǎng)。結果顯示：這一階段牛睪丸適宜支持細胞分離純化用；采用0.25﹪胰蛋白酶+0.02﹪EDTA二次消化法是一種經濟有效的牛胎兒睪丸支持細胞分離方案；試驗發(fā)現，牛胎兒睪丸支持細胞體外研究時間應控制在3天～20天內，處于對數生長期的牛胎兒睪丸支持細胞，對牛體外受精卵體外發(fā)育有明顯的促進作用。 2．牛雄性生殖系干細胞分離純化后與睪丸支持細胞共培養(yǎng)。結果顯示：睪丸支持細胞

3、對雄性生殖系干細胞體外增殖、分化是必需的，同時對數期睪丸支持細胞對雄性生殖系干細胞貼壁、增殖與分化效果明顯；共培養(yǎng)16天后，牛雄性生殖系干細胞成功分化為長形精子細胞，試驗初步建立了牛雄性生殖系干細胞體外誘導培養(yǎng)分化體系。 3．牛雄性生殖系干細胞分離純化后，進行冷藏、冷凍保存研究。結果顯示：牛胎兒睪丸4℃低溫保存的上限時間為48h；牛胚胎程序化冷凍、精液冷凍及胚胎玻璃化冷凍保存方案，不適于雄性生殖系干細胞的冷凍保存；雄性生殖系干細