人可溶性BLyS結(jié)合肽的篩選及其免疫抑制功能分析.pdf

1、B淋巴細(xì)胞刺激因子(B-lymphocytestimulator，BLyS)，又稱可誘導(dǎo)凋亡并活化NF-κB和JNK的TNF同源物(TNFhomologuethatactivatesapoptosis，NF-κBandJNK，THANK)、TNF家族的B細(xì)胞活化因子(BcellactivatingfactorbelongingtotheTNFfamily，BAFF)、TNF和凋亡配體相關(guān)的白細(xì)胞表達配體1(TNF-andapoptosi

2、sligand-relatedleukocyteexpressedligand1，TALL-1)和zTNF4等，是一個重要的B細(xì)胞存活因子。BLyS能夠促進B細(xì)胞成熟增殖和分化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生IgG抗體。目前已經(jīng)證實BLyS缺失能夠?qū)е鲁墒霣細(xì)胞缺陷。BLyS過表達是系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、干燥綜合征(Sjogren'ssyndrom)等自身免疫性疾病的重要原因之一，對BLyS進行研究并開發(fā)BLyS拮抗劑中和其活性

3、對這些疾病的診斷和治療具有重要意義。 噬菌體呈現(xiàn)技術(shù)自發(fā)現(xiàn)以來已經(jīng)成為研究蛋白質(zhì)相互作用的有力工具。同傳統(tǒng)的藥物開發(fā)相比，噬菌體肽庫在容量、篩選通量和親和選擇范圍等方面具有其獨到的優(yōu)勢。研究表明生物大分子之間的相互作用，實質(zhì)上是功能位點間的相互作用，并不需要整個分子的完全接觸。肽庫中包含了極大量的、在氨基酸組成或序列上相互有差異的小肽，這些小肽呈現(xiàn)于噬菌體表面，它們可以在序列上充當(dāng)或模擬生物大分子間相互作用的功能位點。因此利用噬

4、菌體呈現(xiàn)技術(shù)尋找BLyS結(jié)合肽作為BLyS拮抗劑，將為相關(guān)疾病的診斷和治療開辟新的方向。 本研究首先制備了人可溶性BLyS蛋白作為靶分子，進行噬菌體肽庫篩選，其后對得到的小肽進行了免疫抑制功能鑒定。 方法和結(jié)果：高純度和活性rhBLyS112-285的制備在大腸桿菌DH5α中誘導(dǎo)表達BLyS胞外區(qū)112至285活性片段的融合蛋白，經(jīng)Ni2+-NTA親和層析、SepharcrylS-200凝膠過濾層析，選擇不同谷胱甘肽氧化

5、還原體系進行純化、復(fù)性條件的優(yōu)化。純化蛋白在SDS-PAGE上呈現(xiàn)單一條帶，凝膠成像系統(tǒng)軟件分析純化蛋白的純度大于90％。 rhBLyS112-285結(jié)合肽的篩選以純化的重組rhBLyS112-285融合蛋白為靶，采用固體包被法對噬菌體展示隨機環(huán)七肽庫及十二肽庫進行親和篩選。ELISA實驗、競爭ELISA實驗鑒定特異結(jié)合的高親和力陽性噬菌體單克隆。 DNA測序和陽性克隆的功能分析DNA測序獲得與rhBLyS112-285

6、高親和力的噬菌體展示環(huán)七肽單克隆3個。經(jīng)細(xì)胞增殖實驗從測序后的陽性噬菌體展示肽中選擇能夠抑制rhBLyS112-285功能的噬菌體克隆。 小肽合成以及其功能分析對能夠抑制rhBLyS112-285功能的噬菌體克隆進行小肽合成，分離正常人外周血淋巴細(xì)胞和小鼠脾細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞增殖實驗鑒定可抑制rhBLyS112-285功能的小肽。 本研究在構(gòu)建rhBLyS112-285表達載體并獲得較高純度及活性蛋白的基礎(chǔ)上，利用噬菌體隨機肽