檢測人可溶性HVEM雙抗體夾心ELISA法的建立及部分自身免疫病患者可溶性HVEM的檢測.pdf

1、[目的]
　　 共刺激分子HVEM(herpesvirus entry mediator，HVEM)又稱TR2，是新近發(fā)現(xiàn)的TNF受體超家族的成員，表達(dá)在多種免疫細(xì)胞表面，包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)及樹突狀細(xì)胞(DC)，扮演一個(gè)雙相調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的角色，通過與配體LIGHT結(jié)合提供給T細(xì)胞一個(gè)正性刺激信號，通過與免疫球蛋白超家族的成員BTLA結(jié)合供給T細(xì)胞一個(gè)抑制性信號，因此有人將HVEM稱作“雙向開關(guān)”(bidi

2、rectionaI Switch)蛋白。研究發(fā)現(xiàn)，HVEM分子在腫瘤、自身免疫病及器官移植排斥反應(yīng)等疾病中扮演重要角色。已證實(shí)自身免疫病患者CD4+T細(xì)胞異常高表達(dá)HVEM和LIGHT，并認(rèn)為LIGHT/HVEM通路使CD4+T細(xì)胞持續(xù)活化，在CD4+T細(xì)胞輔助下，B細(xì)胞產(chǎn)牛大量不同種類的自身抗體，造成組織器官損傷。
　　 本文構(gòu)建人HVEM(hHVEM)原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)表達(dá)重組hHVEM蛋白，采用重組hHVEM蛋白作為抗原制

3、備兔抗人HVEM多克隆抗體，并建立檢測人可溶性HVEM(soluble HVEM，sHVEM)的ELISA夾心法，對部分自身免疫病患者血清sHVEM水平進(jìn)行檢測，以探討sHVEM的檢測對自身免疫病的輔助診斷及病情觀察的意義，并為研究HVEM在自身免疫病發(fā)生、發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 [方法]
　　 1.pET-32a/hHVEM原核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 采用分子克隆技術(shù)，將人HVEM基因序列克隆插入pET-3

4、2a載體，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli DH5α，并對重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。
　　 2.His-hHVEM蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定
　　 將pET-32a/hHVEM重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)重組His-hHVEM蛋白，采用Ni-NTA親和層析純化重組His-hHVEM蛋白，獲得大量可溶性His-hHVEM蛋白，采用SDS-PAGE電泳鑒定。
　　 3.兔抗人HVEM多克隆

5、抗體的制備及鑒定
　　 用純化的重組人HVEM蛋白作為抗原，免疫家兔，制備兔抗人HVEM多克隆抗體，并對其特異性及純度進(jìn)行鑒定。
　　 4.hHVEM ELISA檢測方法的建立
　　 以抗人HVEM單克隆抗體作為包被抗體，純化的重組人HVEM蛋白作為參考標(biāo)準(zhǔn)品，兔抗人HVEM多克隆抗體作為捕獲抗體，HRP標(biāo)記羊抗兔IgG作為二抗，建立檢測可溶性HVEM的ELISA夾心法。
　　 5.自身免疫病患者血清sH

6、VEM的檢測
　　 用建立的檢測sHVEM法對12例類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)、33例強(qiáng)直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、36例系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupuserythematosus，SLE)患者血清sHVEM水平進(jìn)行檢測，并以正常體檢者血清sHVEM作為對照，分析自身免疫病患者與正常體檢者血清sHVEM濃度的差異。同時(shí)采用ELISA法對12例R

7、A和36例SLE患者血清及正常體檢者血清IL-17水平進(jìn)行檢測，并對患者組血清sHVEM、IL-17水平進(jìn)行相關(guān)性分析。
　　 [結(jié)果]
　　 1.pET-32a/hHVEM原核表達(dá)載體的構(gòu)建
　　 經(jīng)PCR及測序鑒定，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-32a/hHVEM。
　　 2.His-hHVEM蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及鑒定
　　 pET-32a/hHVEM重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(D

8、E3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，DE3表達(dá)較高濃度可溶性His-hHVEM蛋白，采用Ni-NTA親和層析純化后，經(jīng)SDS-PAGE電泳鑒定，獲得較高純度的His-hHVEM蛋白。
　　 3.兔抗人His-HVEM多克隆抗體的制備及鑒定
　　 成功制備了兔抗人HVEM多克隆抗體，經(jīng)過硫酸銨鹽析初步純化后，其ELISA效價(jià)為1:12800，多克隆抗體除與重組人HVEM蛋白結(jié)合外，還能結(jié)合自身免疫病患者血清中HVEM，其純度及特異度

9、均達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)要求。
　　 4.可溶性hHVEM ELISA檢測方法的建立
　　 成功建立了可溶性hHVEM ELISA檢測方法，檢測范圍在7.81μg/L～250μg/L之間，批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為8.03％和13.7％，平均回收率達(dá)到了86.3％，說明該方法的準(zhǔn)確度和精密度都較好。
　　 5.自身免疫病患者血清sHVEM的檢測
　　 用以上建立的方法對12例RA、33例AS、36例SLE患者血清sH

10、VEM水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，SLE、RA及AS患者血清sHVEM水平均高于正常對照組。SLE、RA組患者血清IL-17水平均高于正常對照組，且與其sHVEM血清水平呈正相關(guān)。
　　 [結(jié)論]
　　 成功構(gòu)建了pET-32a/hHVEM原核表達(dá)載體，成功表達(dá)、獲得較高純度的His-hHVEM蛋白；成功制備兔抗人HVEM多克隆抗體，建立了sHVEM ELISA檢測方法；初步證實(shí)了sHVEM在SLE、RA及AS患者血清中含量