可溶性HVEM融合蛋白和CIITA突變體聯(lián)合抑制T細胞功能的體外和體內(nèi)研究.pdf

1、T淋巴細胞介導的免疫反應在器官移植排斥中占有關(guān)鍵地位。許多證據(jù)表明T細胞在移植排斥發(fā)生、發(fā)展階段都具有十分重要的作用。T細胞的活化需要“雙信號”系統(tǒng):T細胞受體(T cell receptor,TCR)/主要組織相容性復合體(major histoeompatibilitycomplex,MHC)提供活化的第一信號；APC和T細胞表面的共信號分子提供第二信號,缺乏第二信號,將導致T細胞無反應,誘導免疫耐受。共信號分子表達于T細胞表面,其

2、與配體結(jié)合不僅能增強T細胞與抗原遞呈細胞(APC)的連接及促進TCR與MHC抗原肽復合物的結(jié)合,還可向T細胞傳遞其完全活化所必須的輔助信號。T細胞不同的共信號通路組成了相互影響、相互依存的多層次級聯(lián)調(diào)控網(wǎng)絡(luò),為調(diào)控T細胞活化及其介導的免疫應答提供了有效的靶點,將T細胞作為靶細胞通過各種途徑阻斷其活化是免疫治療的可行方案。 B和T細胞衰減分子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)是共信號分子免疫球

3、蛋白超家族的最新成員,與CTLA-4有一定的同源性,為抑制型受體。皰疹病毒進入調(diào)節(jié)子(herpesvirus entry mediator,HVEM)是BTLA唯一的配體,屬于TNFR家族的成員。研究發(fā)現(xiàn)HVEM-BTLA可介導抑制信號的傳遞,抑制T細胞的增殖和細胞因子的表達,且這一抑制功能的發(fā)揮具有TCR復合物依賴性。 主要組織相容性復合體(MHC)II類分子可將外源性抗原遞呈給T輔助細胞,引起抗原特異性T細胞的活化,MHC

4、II類分子表達的調(diào)控主要在轉(zhuǎn)錄水平,其中反式作用因子(MHC II transactivator,CIITA)是MHC II類基因表達的“分子開關(guān)”,決定著MHC-II類分子的存在與否及表達程度,也決定了免疫應答的本質(zhì)。因此CIITA是對MHC-II類分子遞呈抗原過程進行干預的理想靶點,可以在自身免疫損傷和移植排異過程中進行免疫抑制干預。 基于上述兩個方面,本研究構(gòu)建了HVEM融合蛋白真核表達體系,并對表達產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)進行了鑒定,

5、然后以自行制備的HVEM-Ig融合蛋白為工具激活BTLA-HVEM通路、抑制TCR/CD3復合物介導的T細胞激活；同時聯(lián)合給予攜帶了CIITA突變體的重組腺病毒,通過CIITA突變體競爭性抑制野生型CIITA的生物學活性,促使MHC II類分子表達降低,在體內(nèi)體外觀察其對T細胞的作用,為后續(xù)探討其應用于移植排斥反應的可行性提供實驗支持。 第一部分 HVEM-Ig融合蛋白真核表達體系的建立及表達產(chǎn)物的鑒定為了對HVEM-BTLA這

6、一共信號通路進行深入研究,我們構(gòu)建了鼠HVEM胞外區(qū)和鼠IgG2a Fc段重組真核表達質(zhì)粒,并在CHO細胞中實現(xiàn)了HVEM-Ig融合蛋白的穩(wěn)定分泌性表達。首先RT-PCR從BALB/c小鼠脾細胞總RNA中擴增HVEM胞外區(qū)片段,WT-1雜交瘤細胞總RNA中擴增鼠IgG2a Fc片段,連入真核分泌型表達載體pSecTagA,獲得重組質(zhì)粒pSecTagA-HVEMIg。將重組質(zhì)粒pSecTagA-HVEMIg用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CHO細胞,Hycr

7、omycin B加壓篩選,建立穩(wěn)定表達HVEM-Ig的CHO細胞庫。用Mouse IgG ELISA試劑盒檢測各細胞克隆的表達量,篩選表達量大于1pg/cell·24h的細胞克隆進行保留；再進行穩(wěn)定性實驗,最終保留5個連續(xù)三次檢測結(jié)果均大于1pg/cell·24h的克隆,用于大規(guī)模轉(zhuǎn)瓶擴增。高表達細胞克隆進行大規(guī)模轉(zhuǎn)瓶細胞培養(yǎng),細胞擴增期用含10％FCS的1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并保持Hygromycin B篩選壓力,待細胞長滿轉(zhuǎn)瓶后,換無

8、血清培養(yǎng)液培養(yǎng)5-7天,收集上清液。利用Protein A與目的蛋白IgG2aFc段特異性結(jié)合的性質(zhì),采用rProtein A-Sepharose FF親和層析,快速獲取目的蛋白。 將獲得的目的蛋白進行結(jié)構(gòu)確認實驗,證實表達產(chǎn)物為HVEM-Ig融合蛋白：SDS-PAGE在還原狀態(tài)下檢測到約45 kD的特異蛋白,而在非還原狀態(tài)下可檢測到約90 kD和120kD的兩種特異蛋白,說明表達產(chǎn)物為二聚體或三聚體形式,符合HVEM-Ig融合

9、蛋白的表達形式。Western Blot分析該樣品可被抗鼠HVEM抗體特異性識別,證明該蛋白為HVEM-Ig融合蛋白。 第二部分：攜帶CIITA突變體的腺病毒的制備、擴增及純化以及體外活性檢測CIITA突變體基因的獲得是以小鼠Ⅳ型CIITA基因的cDNA片段為模板通過PCR-SOE的方法構(gòu)建N端缺失第325-678位堿基的突變體。然后通過同源重組的方法獲得攜帶CIITA突變體的腺病毒骨架pAd-CIITA,轉(zhuǎn)染入HEK293細胞

10、擴增后獲得完整的重組腺病毒顆粒Ad-CIITA。用CsCl密度梯度超速離心的方法對重組腺病毒進行純化,并用TCID50法計算病毒滴度。然后將純化的重組腺病毒Ad-CIITA感染HeLa細胞,用流式細胞術(shù)觀察介導表達的CIITA突變體抑制誘導型MHC-Ⅱ類分子表達的作用。結(jié)果顯示用重組腺病毒Ad-CIITA感染HeLa細胞株,使IFN-γ誘導表達MHC-Ⅱ類分子的細胞陽性率比對照組下降40～45％,平均減少42.5％；平均熒光強度降低62

11、～67％,平均下降64.5％。說明重組腺病毒Ad-CIITA介導的CIITA突變體基因轉(zhuǎn)移可以抑制細胞表面誘導型MHC-Ⅱ類分子表達。 第三部分 HVEM-Ig融合蛋白的體外功能研究及其聯(lián)合CIITA突變體的體內(nèi)研究絲裂霉素處理的C57BL/6鼠脾細胞,與BALB/c鼠T細胞混合,加入不同濃度HVEM-Ig或?qū)φ誌gG,進行混合淋巴細胞反應(MLR),結(jié)果：[3H]-TdR摻入法顯示HVEM-Ig呈劑量依賴性的抑制同種T細胞增殖

12、(HVEM-Ig終濃度為150μg/ml時抑制率約50％)(P＜0.05),而IgG對同種T細胞的增殖沒有影響。HVEM-Ig組培養(yǎng)上清中TNF-α、IFN-γ、IL-2和IL-10的水平均低于于未處理和對照IgG組(P＜0.05),IL-4的水平各組沒有明顯差異。用CD3抗體和亞劑量CD25刺激BALB/c鼠T細胞,加入HVEM-Ig或?qū)φ誌gG,3H-TdR摻入法觀察T細胞增殖情況,結(jié)果同MLR結(jié)果類似,上清中各細胞因子分泌水平同前

13、述實驗符合。收集同樣處理的T細胞經(jīng)穿膜后用流式抗體進行標記,觀察胞內(nèi)細胞因子分泌情況,HVEM-Ig處理組同對照組相比胞內(nèi)IL-10表達降低。 利用新型熒光染料CFSE體內(nèi)研究HVEM-Ig聯(lián)合CIITA突變體對同種異體T細胞免疫功能的抑制作用。CFSE具有與活體細胞結(jié)合并隨細胞分裂熒光強度系列減半的特性,通過流式細胞術(shù)實現(xiàn)對體內(nèi)細胞8至10個分裂周期的可視化,成為研究體內(nèi)環(huán)境下淋巴細胞增殖情況的新技術(shù)。取BALB/C鼠T細胞體

14、外用CFSE染色后尾靜脈輸入經(jīng)9 Gy Co60輻照后的C57BL/鼠體內(nèi),在第0,2天注射HVEM-Ig融合蛋白和重組腺病毒Ad-CIITA,對照組注射IgG和空載病毒Ad-GFP。3天后殺C57BL/6鼠取脾和淋巴結(jié)細胞流式觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)同對照組相比實驗組CD4+T、CD8+T細胞增殖明顯減低。這些結(jié)果提示聯(lián)合應用。HVEM-Ig和CIITA突變體可以抑制同種異體T細胞的活化和增殖。 結(jié)論：本課題成功構(gòu)建了HVEM-Ig融合

15、蛋白真核表達體系,表達及純化HVEM-Ig融合蛋白,并對蛋白的結(jié)構(gòu)進行了鑒定,為后續(xù)實驗提供了研究工具。在此基礎(chǔ)上將已構(gòu)建好的攜帶CIITA突變體基因的重組腺病毒骨架轉(zhuǎn)染HEK293細胞擴增,獲得完整的重組腺病毒顆粒Ad-CIITA,并體外驗證了其活性。實驗結(jié)果表明在體外單獨應用HVEM-Ig融合蛋白可以抑制T細胞的增殖和細胞因子的分泌,CIITA突變體重組腺病毒可以抑制MHC II類分子的表達。最后體內(nèi)聯(lián)合應用純化的HVEM-Ig融合