大豆葉形突變體的遺傳和功能分析.pdf

1、大豆[Glycine max L.Merr.]屬于豆科、蝶形花亞科、大豆屬，是世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟作物，為人類提供了大量的植物蛋白以及油料。大豆是古四倍體，基因組大小為1.1 Gb，編碼蛋白質(zhì)的基因超過46430個，其中大約有75％的基因是以同源基因的形式出現(xiàn)的。由于大豆基因組復(fù)雜，遺傳轉(zhuǎn)化較為困難，一直以來對大豆基因功能的研究進展較為緩慢。隨著大豆基因組序列的公布，大豆遺傳學(xué)研究邁入了新的時代。本文通過篩選菏豆12突變體庫，獲得葉皺縮

2、表型的突變體。通過重測序技術(shù)獲得菏豆12基因組序列信息，并與參考基因組Williams82進行序列比對得到數(shù)量眾多的插入缺失片段的物理位置信息，并以此開發(fā)新的插入/缺失（INsertion/DELetion,INDEL）分子標(biāo)記。與此同時構(gòu)建突變體與Williams82的雜交群體，并通過正向遺傳學(xué)的手段，對造突變的基因進行圖位克隆，利用表型相同的突變體株系之間雜交進行等位鑒定，以及突變體轉(zhuǎn)基因恢復(fù)表型等手段確認(rèn)了該突變體的突變基因。進一

3、步研究發(fā)現(xiàn)，該基因參與了大豆葉表皮角質(zhì)層的發(fā)育過程，并進一步影響了突變體應(yīng)對干旱以及病原菌脅迫。所以該基因?qū)ξ磥砼嘤购狄约翱共【拇蠖剐缕贩N具有重要的意義。具體實驗結(jié)果如下：
　　1.大豆品種之間分子標(biāo)記的篩選
　　1）大豆擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）的設(shè)計以及多態(tài)性的篩選
　　對菏豆12，Williams82，吉林35進行AFLP分析，經(jīng)過統(tǒng)計這三個大豆品種利用27對不同的選擇性擴增引物組合分別獲得625條，61

4、9條，622條條帶，三個品種兩兩之間共產(chǎn)生了410個差異片段，其中菏豆12與吉林35之間有138個差異性位點，菏豆12與Williams82之間有145個差異性位點，吉林35與Williams82之間有127個差異位點。
　　2）大豆SSR分子標(biāo)記的設(shè)計與篩選
　　從BARCSOYSSR Potential SSRs中選取了98個潛在的具有SSR多態(tài)性的位點，對菏豆12，Williams82，吉林35進行了SSR多態(tài)性分析。

5、結(jié)果表明：菏豆12與Williams82之間多態(tài)性位點有41個，占總數(shù)的42%；菏豆12與吉林35之間多態(tài)性位點26個，占總數(shù)的27%；吉林35與Williams82之間多態(tài)性位點16個，占總數(shù)的16%。菏豆12與Williams82之間SSR分子標(biāo)記設(shè)計成功率較高，反映出兩者之間的遺傳多樣性更高，使得兩者成為較合適的構(gòu)建群體組合。
　　3）大豆INDEL分子標(biāo)記的設(shè)計以及篩選
　　本實驗篩選了在染色體上均勻分布的248個I

6、NDEL位點以獲得足夠數(shù)量的錨定分子標(biāo)記。經(jīng)PCR驗證確定共有169個分子標(biāo)記具有多態(tài)性，預(yù)測成功率為69%。169個INDEL分子標(biāo)記分布于所有二十條染色體中，其中分布最多的是Gm01染色體，共分布有24個，最少的也有4個，平均每條染色體上有8個。INDEL分子標(biāo)記的分布基本均勻，很少成簇出現(xiàn)，基本能夠滿足圖位克隆粗定位的要求。運用這些分子標(biāo)記對其他12個大豆品種進行多態(tài)性鑒定發(fā)現(xiàn)：這些分子標(biāo)記在中國和美國品種之間有著良好的多態(tài)性。進

7、一步分析實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)：具有多態(tài)性的分子標(biāo)記中有77%PCR產(chǎn)物是單產(chǎn)物，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于假陽性INDEL的41%，這可能表明位于具有同源序列的INDEL位點可信度較低。生物信息學(xué)分析得到近五萬個INDEL位點當(dāng)中可能會有相當(dāng)一部分是不真實的，造成這個問題的原因可能是重測序片段錯誤地比對上了參考基因組相應(yīng)位置的同源序列，造成了一小段沒有比對上的片段被分析成為INDEL位點。
　　2.大豆皺葉突變體的鑒定
　　在菏豆12伽馬射線誘變突變

8、體庫中篩選出一個株系的皺葉突變體。皺葉突變體的第一三出復(fù)葉葉尖在種植18天之后開始壞死，導(dǎo)致小葉遠(yuǎn)軸端無法伸長，葉細(xì)胞在葉片發(fā)育過程中不斷堆積，形成皺葉的表型。在純化突變體遺傳背景過程中發(fā)現(xiàn)突變體與菏豆12野生型雜交F1代為野生型表型，F(xiàn)2代群體中突變體與野生型的比例為1：3，符合孟德爾遺傳定律，證明該突變位點為隱性單位點突變。
　　3.大豆皺葉突變體的圖位克隆
　　首先構(gòu)建了皺葉突變體與Williams82的雜交群體。在F

9、2代中選取突變體表型植株做圖位克隆。通過粗定位，將突變位點定位于7號染色體1.371Mb和2.417 Mb之間，但再繼續(xù)向內(nèi)設(shè)計分子標(biāo)記的時候發(fā)現(xiàn)一段區(qū)間內(nèi)擴增不出條帶，故懷疑可能存在片段缺失。在缺失邊界附近設(shè)計Inverse PCR引物，最終確定缺失范圍是7號染色體2118557到2371744 bp。內(nèi)共包含有27個基因涉及脂肪酸代謝，甘油代謝，生長素極性運輸?shù)认嚓P(guān)功能。
　　4.突變基因的確定
　　隨后又在Willia

10、ms82伽馬射線誘變，EMS誘變突變體庫中篩選到表型一致的突變體株系4個，編號分別為：MSN7442，SC5591，SC5962，SC7321。菏豆12與MSN7442雜交后發(fā)現(xiàn)F1代為突變體表型，證明兩個株系的突變位點是等位關(guān)系。提取MSN7442株系突變體的基因組DNA，將菏豆12突變體缺失的27個基因進行PCR擴增并測序，發(fā)現(xiàn)在Glyma.07G028600（Soybase v1.1版本的該基因編號為Glyma07g03230）基

11、因外顯子出存在G到T的堿基顛換，導(dǎo)致編碼的氨基酸由天冬氨酸變?yōu)槔野彼?。對其余三個株系的Glyma.07G028600基因PCR擴增并測序之后發(fā)現(xiàn)：SC7321在外顯子處缺失TCTTTTATCC十個堿基并加入A；SC5591在第三個外顯子前2個堿基的內(nèi)含子處存在一個由A到T的堿基顛換，推測可能導(dǎo)致了mRNA的錯誤剪切；SC5962在外顯子處有一個G到A的堿基替換，導(dǎo)致編碼的氨基酸由甘氨酸變?yōu)榫彼?。綜上測序的結(jié)果表明：這四個株系的突變體在

12、Glyma.07G028600基因上存在非同義突變，并且菏豆12皺葉突變與MSN7442為等位突變體。構(gòu)建Glyma.07G028600過表載體，并遺傳轉(zhuǎn)化MSN7442，突變體表型恢復(fù)為野生型。以上實驗證明Glyma.07G028600基因的突變造成了皺葉的表型。
　　5.Glyma.07G028600基因的表達模式
　　Glyma.07G028600基因編碼甘油三磷酸激酶，其在擬南芥中的直系同源基因是NHO1/GLI1。

13、擬南芥nho1突變體的非寄主性抗性降低導(dǎo)致突變體對病原菌的侵染不耐受。大豆Glyma.07G028600基因在全身各組織器官中均有表達，其中果莢中的表達豐度最高，葉片次之。構(gòu)建Glyma.07G028600融合eGFP過表載體，轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，結(jié)果表明融合蛋白主要定位于細(xì)胞膜上。莖尖原位雜交的結(jié)果表明該基因在大豆莖尖分生組織，葉原基等處均有表達。
　　6.Glyma.07G028600基因的功能分析
　　菏豆12背景的皺

14、葉突變體較其野生型，Williams82背景下的4個株系的皺葉突變體較其野生型的離體葉片失水速率均快一倍以上。由此推測突變體葉表皮的角質(zhì)層可能存在問題。掃描電鏡結(jié)果顯示：突變體葉表面的蠟質(zhì)晶體堆積不正常。突變體及野生型葉片橫切切片的透射電鏡結(jié)果表明：突變體的表皮層變薄；真角質(zhì)層親鋨性降低，表明突變體角質(zhì)的密度變低。對突變體及野生型表層蠟質(zhì)進行的質(zhì)譜分析表明：突變體和野生型的蠟質(zhì)總量沒有顯著區(qū)別，但不同成分含量差別很大。突變體和野生型接種

15、大豆細(xì)菌斑點病菌4天后，突變體葉子內(nèi)的細(xì)菌數(shù)量是野生型的6倍多，證明突變體應(yīng)對病原菌侵染的能力變低。
　　7.角質(zhì)層發(fā)育相關(guān)基因的表達豐度受Glyma.07G028600基因影響
　　結(jié)合掃描電鏡，透射電鏡，以及蠟質(zhì)成分質(zhì)譜分析的結(jié)果，對涉及植物蠟質(zhì)，角質(zhì)合成，轉(zhuǎn)運，組裝，調(diào)控的20多個基因在野生型和突變體葉片中的表達豐度進行了分析，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)運相關(guān)基因表達豐度差異不顯著。角質(zhì)合成酶基因（GmLTL1）等合成相關(guān)基因在野生

16、型和突變體中表達豐度差異很大，一些轉(zhuǎn)錄因子表達豐度差異也很大。推測Glyma.07G028600基因?qū)χ参锝琴|(zhì)層的發(fā)育起著重要的作用。
　　本論文的主要創(chuàng)新點：
　　1.開發(fā)了一定數(shù)量的INDEL分子標(biāo)記，這些標(biāo)記在其他大豆品種之間也具有較好的多態(tài)性。生物信息學(xué)比對得到的近五萬個INDEL位點能夠為大豆遺傳以及分子輔助育種提供豐富的信息。這些數(shù)據(jù)已經(jīng)上傳至Soybase，并填補了大豆公共數(shù)據(jù)庫中沒有INDEL分子標(biāo)記的空白。