表達(dá)HLA DR-結(jié)核分枝桿菌肽復(fù)合物細(xì)胞株的構(gòu)建.pdf

1、研究背景和目的： 結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)感染引起的慢性傳染病。全世界有三分之一的人感染MTB，其中5％～10％的感染者發(fā)展成為活動(dòng)性結(jié)核病，是否發(fā)病不僅與侵入機(jī)體的細(xì)菌數(shù)量和毒力等因素有關(guān)，還與機(jī)體的免疫功能有關(guān)。MTB為胞內(nèi)寄生菌，故機(jī)體的抗結(jié)核免疫主要依靠T細(xì)胞為主的細(xì)胞免疫，T細(xì)胞通過TCR識(shí)別抗原，識(shí)別過程受主要組織相容性(抗原)復(fù)合物(major hist

2、ocompability complex，MHC)的限制。MTB感染機(jī)體后，抗原遞呈細(xì)胞(antigen present cells，APCs)對(duì)其進(jìn)行加工處理，與APCs表面的人類白細(xì)胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)形成HLA／肽復(fù)合物，TCR特異性識(shí)別HLA/肽復(fù)合物，進(jìn)而介導(dǎo)一系列的免疫反應(yīng)。 因此，TCR與HLA／肽的特異性相互作用可用于抗原特異性T細(xì)胞的檢測。但是HLA／肽單體雖然能與T

3、CR結(jié)合，但親和力低，解離速度快，而不能直接用來檢測抗原特異性T細(xì)胞。Altman等于1996年創(chuàng)建了可溶性MHC／肽四聚體技術(shù)，將復(fù)合物單體四聚化，從而大大提高了MHC／肽復(fù)合物與TCR的親和力和穩(wěn)定性，使這一難題得到解決。 目前，MHC Class Ⅰ／肽四聚體已被廣泛用于分析CD8+T細(xì)胞在抗病毒、抗腫瘤和自身免疫病中的作用。傳統(tǒng)制備MHC Class Ⅰ／肽四聚體的方法是分別制備可生物素化的重鏈和β2m，然后二者再和特異

4、性抗原肽在體外一起折疊復(fù)性，形成MHC Class Ⅰ／肽復(fù)合物，形成的復(fù)合物單體與帶有4個(gè)親生物素亞基的鏈霉親和素以4:1比例混合構(gòu)建成四聚體。相比Ⅰ類分子，MHC Ⅱ類分子(DR)是由α鏈和β鏈以非共價(jià)鍵形成的異二聚體，兩條鏈都具有多態(tài)性，體外折疊時(shí)往往不能很好的錨合短肽，其四聚體的制備要復(fù)雜得多。據(jù)Novak報(bào)道，在α、β鏈的C端連上亮氨酸拉鏈基序和連接蛋白，且β鏈上加上可生物素化的底物肽(BSP)，經(jīng)大量表達(dá)、純化、生物素化后，

5、與多肽共孵育，形成MHC Class Ⅱ／肽復(fù)合物，再與藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鏈霉親和素結(jié)合形成MHC Class Ⅱ／肽四聚體。用原核表達(dá)體系從大腸桿菌包涵體分離出的MHC Ⅱ類分子結(jié)構(gòu)往往不穩(wěn)定，后來多采用桿狀病毒．昆蟲表達(dá)體系。MHC Ⅱ類分子必須完成生物素化才能與鏈霉親和素結(jié)合形成四聚體，體外生物素化需要購買昂貴的BirA酶，而且在純化和濃縮過程中會(huì)丟失20％～50％的蛋白。鑒于這些原因，研究者們又創(chuàng)建了與α、β鏈與BirA酶基

6、因共轉(zhuǎn)染的方法，從而使MHC Ⅱ／肽四聚體的制備過程更快捷經(jīng)濟(jì)。本實(shí)驗(yàn)的目的是擴(kuò)增結(jié)核患者HLA Class Ⅱβ鏈(DRB)全長序列，對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行分析比對(duì)，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)HLA DR／肽復(fù)合物的細(xì)胞株：一種表達(dá)于細(xì)胞膜上，以期用來分析和鑒定TCR四聚體α、β鏈的最佳組合和功能；另一種是分泌表達(dá)可生物素化的雙鏈單體、以用來制備HLA DR／肽四聚體，為探索和發(fā)展其作為結(jié)核診斷與研究用新方法和新型疫苗的可能性建立基礎(chǔ)。 研究內(nèi)

7、容和方法：分離MTB多肽陽性反應(yīng)的活動(dòng)性結(jié)核患者胸水(PLF)和外周血(PBMC)標(biāo)本中的淋巴細(xì)胞，提取其總RNA，利用Switch Mechanism At 5'-end of Reverse Transcript(SMART)逆轉(zhuǎn)錄獲得全長cDNA，并通過LD PCR合成互補(bǔ)鏈。根據(jù)GenBank已有HLA-DRB序列分別設(shè)計(jì)能擴(kuò)增包括HLA Class Ⅱ DR β鏈先導(dǎo)序列起始密碼和終止密碼的上下游引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得完整的H

8、LA Class Ⅱ DR β鏈(DRB)編碼序列。PCR回收產(chǎn)物連接入pGEM-Teasy載體，藍(lán)白篩選得到陽性克隆，委托公司測序。測序結(jié)果利用DNAstar分析軟件及網(wǎng)上資源進(jìn)行分析、比對(duì)，得到不同的等位基因。得到的等位基因一方面以全長的形式克隆入表達(dá)載體pMT／V5／His-A，與帶有MTB多肽的HLA Class Ⅱα鏈(DRA)全長表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，蛋白分子表達(dá)于胞膜上；另一方面設(shè)計(jì)去除HLA Class Ⅱβ鏈跨膜

9、區(qū)和胞內(nèi)區(qū)編碼基因，然后在C端連入編碼親水性氨基酸基因和生物素化酶底物基因，克隆入表達(dá)載體pMT／V5/His-B構(gòu)建分泌表達(dá)重組載體，與α鏈分泌表達(dá)重組載體及BirA表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染S2細(xì)胞后以生物素化的二聚體的形式分泌表達(dá)于胞外。 結(jié)果：本實(shí)驗(yàn)分別從8位MTB多肽陽性反應(yīng)的結(jié)核患者外周血或胸水標(biāo)本中擴(kuò)增出了完整的HLA Class Ⅱ DR β鏈(DRB)編碼序列，共得到26個(gè)陽性克隆，經(jīng)過序列分析比對(duì)，最終獲得8種HLA D

10、RB等位基因克隆，其中各有2位患者存在相同的等位基因HLA DRB1*0818或DRB1*150101(見表1)。結(jié)合本課題組其他成員的結(jié)果分析HLA DRB1*0818等位基因的頻率(共17例，占總例數(shù)的40.5％)高于其他等位基因(見表2)。分別構(gòu)建了8個(gè)全長序列pMT重組表達(dá)載體和8個(gè)pMT重組分泌表達(dá)載體，分別以此亞克隆重組載體與分別帶有不同MTB多肽的α鏈重組表達(dá)載體配對(duì)轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞?？傻玫絻煞N形式的表達(dá)HLA DR／肽復(fù)

11、合物單體的細(xì)胞株：與4種帶有不同MTB多肽的α鏈全長表達(dá)載體配對(duì)轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定獲得9個(gè)細(xì)胞膜上表達(dá)HLA DR／肽復(fù)合物單體的穩(wěn)定細(xì)胞株；另一種是與2種帶有不同MTB多肽的α鏈分泌表達(dá)載體配對(duì)及BirA表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染果蠅S2細(xì)胞，Dot Blotting鑒定獲得16個(gè)分泌表達(dá)生物素化的HLA DR／肽復(fù)合物單體的細(xì)胞株。 結(jié)論 1.采用SMART和LD-PCR的技術(shù)方法克服樣本量小的問題，利于對(duì)一

12、份樣本進(jìn)行多個(gè)方面的研究。 2.序列分析顯示同一標(biāo)本可得到不同的HLA-DRB等位基因，不同的標(biāo)本也有相同的HLA-DRB等位基因；HLA DRB1*0818等位基因的頻率(共17例，占總例數(shù)的40.5％)高于其他等位基因，提示其與結(jié)核易感可能具有相關(guān)性。 3.獲得穩(wěn)定表達(dá)跨膜HLA DR／MTB肽復(fù)合物單體的恒定S2細(xì)胞株9株，可作為APC用于CD4+ TCR四聚體的α和β鏈最佳配對(duì)檢測和功能研究。 4.獲得穩(wěn)