高通量結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶表達(dá)篩選平臺(tái)的構(gòu)建與應(yīng)用.pdf

1、結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的病原菌，近年來(lái)隨著結(jié)核耐藥及結(jié)核與HIV共感染的問(wèn)題越來(lái)越嚴(yán)重，結(jié)核病有死灰復(fù)燃的趨勢(shì)。對(duì)結(jié)核分枝桿菌的研究是解決結(jié)核病難題的關(guān)鍵之一，結(jié)核分枝桿菌的致病機(jī)理研究和關(guān)鍵藥物靶點(diǎn)的結(jié)構(gòu)與功能研究都需要重組表達(dá)信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白或者藥物靶標(biāo)蛋白。
　　然而結(jié)核分枝桿菌蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究由于受結(jié)核分枝桿菌蛋白難以可溶表達(dá)和純化的影響而進(jìn)展緩慢。融合標(biāo)簽技術(shù)是近年來(lái)興起的一項(xiàng)重組DNA技術(shù)，在重組蛋白的純化

2、、促進(jìn)重組蛋白的表達(dá)、幫助重組蛋白正確折疊、提高重組蛋白的可溶性及穩(wěn)定性等方面有很大的應(yīng)用價(jià)值。
　　為找到能更好的表達(dá)結(jié)核分枝桿菌蛋白的重組表達(dá)系統(tǒng)，解決結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶表達(dá)的難題，將多個(gè)能促進(jìn)可溶表達(dá)的蛋白標(biāo)簽與高通量的Gateway克隆技術(shù)相結(jié)合，構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶表達(dá)快速通量的篩選平臺(tái)。在保證蛋白分子量大小平均分布的前提下隨機(jī)挑選46個(gè)已知以包涵體形式表達(dá)或者不表達(dá)的結(jié)核分枝桿菌蛋白的基因，分別克隆到帶有N-末

3、端Nus.A、SUMO、MBP、Trx.a、ACP五種蛋白標(biāo)簽基因的載體上，酶切驗(yàn)證成功后轉(zhuǎn)化Rosetta(DE3)表達(dá)菌株。重組蛋白表達(dá)載體在Rosetta表達(dá)菌株中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá);采用Tricine-SDS-PAGE分析重組蛋白表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)核桿菌重組蛋白表達(dá)情況，比較5種蛋白融合標(biāo)簽的促溶效果。
　　統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，Nus.A、SUMO、MBP、Trx.a、ACP五種蛋白融合標(biāo)簽均可促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白在大腸桿菌中

4、可溶表達(dá)，其中Nus.A融合標(biāo)簽促溶效果明顯優(yōu)于其他4種蛋白融合標(biāo)簽;當(dāng)融合Nus.A標(biāo)簽蛋白基因后，可顯著促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白在大腸桿菌中可溶表達(dá)。融合Nus.A標(biāo)簽后，可溶表達(dá)的蛋白數(shù)量占總樣品數(shù)的比例提高到41％，與未融合標(biāo)簽的菌株相比提高了32％;同時(shí)其他的標(biāo)簽SUMO、MBP、Trx.a、ACP融合蛋白可溶表達(dá)數(shù)量占總樣本數(shù)的比例分別提高到21％、26％、26％、21％，雖然可溶蛋白比例沒(méi)有Nus.A融合蛋白高，但也均能不

5、同程度的促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌蛋白可溶表達(dá)。
　　本文成功構(gòu)建帶有N-末端Nus.A、SUMO、MBP、Trx.a、ACP五種蛋白融合標(biāo)簽基因的原核表達(dá)載體，并且與高通量的Gateway克隆技術(shù)相結(jié)合，建立了結(jié)核分枝桿菌重組蛋白可溶表達(dá)的快速通量篩選平臺(tái)。本研究構(gòu)建的載體引入了Gateway反應(yīng)位點(diǎn)attR1-ccdB-attR2，克服了克隆位點(diǎn)不一致、重組蛋白性質(zhì)不同等原因不能高通量表達(dá)、純化異源蛋白的困難;所有結(jié)核分枝桿菌蛋白基因均

6、可采用Gateway克隆技術(shù)高通量的重組到構(gòu)建的所有載體中，所有克隆均可平行進(jìn)行，且所需實(shí)驗(yàn)時(shí)間很短，節(jié)省了大量的時(shí)間，實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌蛋白基因高效克隆;此外，除MBP融合蛋白外，其余融合蛋白的N端均帶有6個(gè)組氨酸標(biāo)簽(6 His)，因此可以通過(guò)Ni-NTA親和層析進(jìn)行純化，實(shí)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白高效表達(dá)篩選。再者，本研究經(jīng)比較得出Nus.A蛋白融合標(biāo)簽在促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌重組蛋白在大腸桿菌可溶性表達(dá)中有較好作用，為結(jié)核分枝桿菌重組蛋白