結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌感染者血漿差異表達(dá)microRNA的初步篩選與功能分析.pdf

1、目的：結(jié)核分枝桿菌（tuberculosismycobacterium，MTB）與非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculosismycobacterium，NTM）感染肺部疾病患者相比，NTM感染的肺部疾病患者血漿中差異表達(dá)microRNA（miRNA）的篩選及驗(yàn)證，并對(duì)差異表達(dá)miRNA調(diào)控的靶基因及其參與的生物學(xué)功能進(jìn)行分析。
　　方法：1研究對(duì)象選擇：收集唐山市第四醫(yī)院與石家莊第五醫(yī)院2013.10-2014.10期間就診

2、的符合要求的NTM感染肺部疾病患者19例作為NTM組，MTB感染肺部疾病患者37例作為MTB組，取得研究對(duì)象知情同意后取其血漿標(biāo)本并進(jìn)行一般情況調(diào)查。從每組中各選取6例研究對(duì)象用于芯片篩選；其余研究對(duì)象用于Real-time PCR（RT-qPCR）驗(yàn)證。2 NTM感染患者血漿中差異表達(dá)miRNA篩選及驗(yàn)證：（1）采用TaqMan低密度芯片技術(shù)檢測(cè)miRNA的表達(dá)水平，根據(jù)校正后的兩個(gè)樣本間雜交信號(hào)強(qiáng)度的比值進(jìn)行選擇,比值大于1.8表示

3、差異表達(dá)上調(diào)，小于0.7表示差異表達(dá)下調(diào)。（2）采用RT-qPCR技術(shù)驗(yàn)證芯片篩選結(jié)果，兩組間miRNA表達(dá)水平的比較采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。兩組差異表達(dá)miRNA的相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算，2-△△Ct大于1表示表達(dá)上調(diào)，2-△△Ct小于1表示表達(dá)下調(diào)。3差異表達(dá)miRNA靶基因的預(yù)測(cè)及功能分析：通過miRanda、TargetScan和miRwalk三個(gè)數(shù)據(jù)庫聯(lián)合對(duì)NTM組差異表達(dá)m

4、iRNA的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)。基于Gene Ontology數(shù)據(jù)庫對(duì)靶基因進(jìn)行功能預(yù)測(cè)，利用Fisher精確檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算每個(gè)GO中靶基因的顯著性，以P-value＜0.05作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：對(duì)研究對(duì)象一般情況采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，其中年齡變量采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，分類資料采用兩獨(dú)立樣本2?檢驗(yàn)，以P＜0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異標(biāo)準(zhǔn)。
　　結(jié)果：1、NTM組差異表達(dá)miRNA篩選及RT-qPCR驗(yàn)證：（1

5、）NTM組差異表達(dá)miRNA篩選：根據(jù)以下三個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，本研究共篩選出差異表達(dá)miRNA11個(gè)，包括上調(diào)miRNA8個(gè)，分別為hsa-miR-26a，hsa-miR-24，hsa-miR-222，hsa-miR-191，hsa-miR-155，hsa-miR-126，hsa-miR-122，hsa-let-7b；下調(diào)miRNA3個(gè)，分別為hsa-miR-767-3p、hsa-miR-1283、hsa-miR-1281。篩選標(biāo)準(zhǔn)：①芯片初步篩

6、選中上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)較大的miRNA；②參考既往各種感染性疾病中相關(guān)miRNA研究報(bào)道；③被TargetScan、miRwalk和miRanda databases數(shù)據(jù)庫同時(shí)驗(yàn)證過，且在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中功能較為突出。（2）RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果：結(jié)合芯片篩選結(jié)果及以往研究報(bào)道，選取其中上調(diào)倍數(shù)最大的3個(gè)miRNA和全部3個(gè)下調(diào)miRNA進(jìn)行驗(yàn)證，分別為has-let-7b、has-miR-155、has-miR-26a、 has-miR-128

7、1、has-miR-1283、has-miR-767。RT-qPCR驗(yàn)證結(jié)果與芯片篩選結(jié)果一致。2、靶基因預(yù)測(cè)及功能分析：（1）上調(diào)的miRNA調(diào)控了關(guān)鍵基因23個(gè)；下調(diào)的miRNA調(diào)控了關(guān)鍵基因59個(gè)。主要調(diào)控以下三方面的生物學(xué)功能：①通過固有免疫應(yīng)答和調(diào)控噬菌溶酶體對(duì)病菌的吞噬作用而參與炎性反應(yīng)的調(diào)節(jié)；②通過相關(guān)信號(hào)通路影響細(xì)胞周期而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡影響疾病的進(jìn)程；③通過調(diào)控細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移影響NTM患病的進(jìn)展。（2）靶基因Gene On