結核分枝桿菌GlmU在恥垢分枝桿菌中的高表達及反義RNA表達系統(tǒng)的優(yōu)化.pdf

1、由結核分枝桿菌引起的結核病是嚴重危害人類健康的三大疾病之一。世界衛(wèi)生組織（WorldHealthOrganization，WHO）的報告顯示，世界人口的三分之一感染過結核桿菌，全世界每20秒就有一人死于結核病。由于耐多藥（multidrugresistant，MDR）甚至是廣泛耐藥（extensivedrugresistant，XDR）結核桿菌的出現，許多一線甚至一些二線抗結核藥物都無法有效治療結核病，因此尋找新的抗結核藥物迫在眉睫。

2、 結核分枝桿菌的細胞壁在其生存和增殖過程中起著重要的作用，其核心結構由肽聚糖、阿拉伯半乳聚糖、分枝菌酸三種組分連接組成。其中分枝菌酸和聚阿拉伯糖半乳糖通過銜接雙糖（L-鼠李糖-D-N-乙酰葡糖胺）共價連接到肽聚糖分子上。UDP-N-乙酰葡糖胺是N-乙酰葡糖胺的糖基供體，在UDP-N-乙酰葡糖胺的生物合成中，glmU基因編碼的GlmU蛋白具有葡糖胺-1-磷酸乙?；D移酶活性和N-乙酰葡糖胺-1-磷酸尿苷轉移酶活性，催化最后兩步反應。

3、本實驗室張文利通過基因敲除的方法證明了glmU基因為分枝桿菌生長必需基因，因此，GlmU可作為很好的抗結核新藥靶標。 本實驗己建立了測定GlmU酶活性的方法，并以此作為篩選抗GlmU酶抑制劑的分子模型。因此，我們需要構建能上調GlmU蛋白表達的細胞模型來進一步篩選抗GlmU酶抑制劑。另外，為了進一步研究GlmU蛋白表達的下降對分枝桿菌細胞壁結構的影響，我們需要構建能下調GlmU蛋白表達的系統(tǒng)，來下調GlmU蛋白表達水平，并用本實

4、驗制備的抗GlmU的多克隆抗體對glmU反義RNA表達系統(tǒng)所表達的GlmU水平進行檢測。 本論文的目的是：（1）在宿主菌mc2155中高表達TbGlmU，并用檢測GlmU酶蛋白活性的方法來鑒定TbGlmU在恥垢中的高表達；（2）優(yōu)化受四環(huán)素誘導的glmU反義RNA表達系統(tǒng)，用本實驗室制備的GlmU多克隆抗體檢測GlmU蛋白的表達水平；（3）用掃描電鏡觀察GlmU表達減弱的恥垢分枝桿菌形態(tài)學變化。 本論文所獲得的結果如下：

5、 1.表達載體pVV2-TbglmU的構建用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切pET16b-TbglmU質粒，回收和純化glmU基因，將其連接到pVV2表達載體的NdeⅠ和BamHⅠ位點，構建pVV2-TbglmU表達質粒。GlmU蛋白的N端與質粒上的組氨酸標簽形成融合蛋白。 2.TbGlmU蛋白在恥垢分枝桿菌mc2155中的高表達及鑒定將pVV2-TbglmU質粒轉化到mc2155感受態(tài)細胞中使其表達GlmU蛋白。用超聲方法破

6、碎攜帶pVV2-TbglmU的mc2155菌，對上清和沉淀組分進行SDS-PAGE和Westernblotting分析，結果表明TbGlmU蛋白在mc2155中可溶性表達。并利用其酶活性檢測方法來鑒定GlmU在恥垢分枝桿菌中的高表達。 3.反義RNA表達載體pMind-SmglmU（360bp）-AS的構建用NdeⅠ和BamHⅠ雙酶切pMD18-SmglmU（360bp）質粒，回收和純化glmU基因片段，將其連接到pMind反義

7、表達載體的NdeⅠ和BamHⅠ位點，構建pMind-SmglmU（360bp）-AS反義表達質粒。 4.glmU反義RNA的誘導表達與GlmU蛋白的檢測分別用0ng/ml、5ng/ml、20ng/ml的四環(huán)素誘導攜帶pMind-SmglmU（360bp）-AS表達載體的mc2155菌株表達反義RNA，繪制細菌生長曲線，并用本實驗室制備的GlmU多克隆抗體檢測GlmU蛋白的表達水平。結果表明20ng/ml四環(huán)素對mc2155/pM

8、ind-SmglmU（360bp）-AS的生長有明顯的抑制作用，Westernblotting結果表明經過20ng/ml四環(huán)素誘導的mc2155/pMind-SmglmU（360bp）-ASGlmU蛋白的表達明顯減少，證明了glmU反義RNA下調了恥垢分枝桿菌GlmU表達水平。 5.經20ng/ml四環(huán)素誘導的mc2155/pMind-SmglmU（360bp）-AS菌株細胞形態(tài)的變化將經20ng/ml四環(huán)素誘導的mc2155/

9、pMind-SmglmU（360bp）-AS菌株細胞用掃描電鏡觀察其細胞形態(tài)。結果顯示生長了48小時后，菌體表面出現明顯的凸起，甚至溶脹，菌體輪廓亦不清晰，似乎都粘連在一起。說明本實驗優(yōu)化的反義RNA表達系統(tǒng)發(fā)揮了下調GlmU表達的作用，更進一步說明了GlmU蛋白對細胞壁完整性有影響。 結論： 1.在恥垢分枝桿菌中高表達出可溶性TbGlmU蛋白，構建了能上調GlmU表達的菌株，為篩選TbGlmU酶抑制劑提供了細胞模型。