結(jié)核分枝桿菌干擾巨噬細胞自噬的初步研究.pdf

1、由結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起的結(jié)核病是世界上最嚴重的細菌性疾病之一。盡管宿主細胞存在著多種清除結(jié)核分枝桿菌的策略，但結(jié)核分枝桿菌也進化出了對抗宿主細胞殺傷作用的生存機制。研究表明，細胞自噬與結(jié)核分枝桿菌的相互斗爭，是影響該菌能否在宿主細胞中生存的重要因素。然而，參與這一過程的細菌和宿主相關基因仍未得到詳細的闡釋。
　　本研究以結(jié)核分枝桿菌作為研究對象，通過構(gòu)建青色或藍色熒光表

2、達菌株和雙熒光指示自噬的巨噬細胞系以及一套能夠抑制和激活真核基因表達的CRISPRi/CRISPRa系統(tǒng)作為研究工具，以此來揭示調(diào)控結(jié)核分枝桿菌在宿主細胞中存活的相關基因。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.青色/藍色熒光結(jié)核分枝桿菌H37Ra的構(gòu)建。為了方便利用熒光顯微鏡對結(jié)核分枝桿菌的直接觀察，我們將能夠表達青色或者藍色熒光蛋白的pMV261-CFP/BFP質(zhì)粒導入到結(jié)核分枝桿菌H37Ra中。通過篩選，得到了能夠穩(wěn)定表達青色或藍色熒光

3、的結(jié)核分枝桿菌。
　　2.雙熒光指示自噬的巨噬細胞系的構(gòu)建。首先，我們將EGFP基因突變?yōu)镚FPph使其對pH環(huán)境更加敏感，并與mCherry和LC3基因進行串聯(lián)表達。之后，利用CRISPR/Cas基因編輯技術，將GFPph-mCherry-LC3融合基因插入到Raw264.7細胞基因組中。通過多輪的挑斑篩選以及流式技術的純化，我們獲得了高陽性率的GphML-Raw264.7細胞。通過對基因組的測序以及Western Blot技術

4、驗證相關蛋白的表達，確認細胞系的構(gòu)建成功。最后，利用自噬誘導劑進行驗證，確認該細胞系可以有效地指示自噬的發(fā)生。
　　3.結(jié)核分枝桿菌蛋白對自噬干擾的分析。為了探究哪些細菌蛋白通過干預自噬而參與調(diào)控結(jié)核分枝桿菌長期潛伏于巨噬細胞，我們將經(jīng)過密碼子優(yōu)化的33個結(jié)核相關蛋白與GphML-Raw264.7細胞進行共孵育，通過雷帕霉素誘導自噬發(fā)生，在特定時間點利用激光共聚焦顯微鏡分析自噬的發(fā)生狀況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Rv0847處理細胞中綠色熒光點與

5、紅色熒光點可以共定位，說明Rv0847可以干擾自噬體與溶酶體的融合。以上結(jié)果說明Rv0847可能干擾自噬溶酶體的融合，從而參與結(jié)核分枝桿菌在細胞內(nèi)的存活。
　　4.宿主自噬基因gRNA文庫的構(gòu)建。利用CRISPRi/CRISPRa技術，我們可以在真核細胞基因組上抑制或者激活基因的表達。我們將該系統(tǒng)及相關質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞，結(jié)果顯示其可有效地激活或者抑制相關基因的表達。之后，我們篩選了所有參與到自噬過程中的相關基因，并通過NCBI