結(jié)核分枝桿菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)對小鼠巨噬細(xì)胞自噬的抑制作用.pdf

1、目的:建立可以穩(wěn)定表達(dá)紅色熒光蛋白-綠色熒光蛋白-微管相關(guān)蛋白輕鏈3(RFP-GFP-LC3)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系，為自噬研究提供材料。研究結(jié)核分枝桿菌分泌性酸性磷酸酶(SapM)對小鼠巨噬細(xì)胞自噬的影響，探究Rab7在結(jié)核桿菌毒力因子SapM誘導(dǎo)的自噬體-溶酶體融合阻斷中的作用。
　　方法:
　　1.用分子克隆的方法構(gòu)建含RFP-GFP-LC3基因的慢病毒重組質(zhì)粒載體，將重組質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HEK

2、293T細(xì)胞，收集病毒液上清后感染RAW264.7細(xì)胞。經(jīng)嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)RFP-GFP-LC3的RAW264.7細(xì)胞株，分別用熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀分析感染效率。饑餓處理穩(wěn)定感染的細(xì)胞，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)的RFP-GFP-LC3斑點(diǎn)。
　　2.分別用SapM、渥曼青霉素、饑餓處理GFP-LC3-RAW264.7細(xì)胞。熒光顯微鏡下觀察自噬體的形成，Western blot法檢測微管相關(guān)性蛋白輕鏈3(LC3)Ⅱ水平;再用

3、SapM處理GFP-LC3-RAW264.7細(xì)胞后加氯喹，Western blot法檢測LC3Ⅱ水平。
　　3.siRab7轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，用蛋白免疫印記檢測P62。mCherry-SapM轉(zhuǎn)染RAW264.7后免疫組化分析SapM與Rab7共定位情況，免疫共沉淀分析SapM與Rab7的關(guān)系。用三種SapM的突變體SapM△arcA，SapM△FReD和SapM△CT轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞，分析SapM的不同突變體與R

4、ab7的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　1.成功構(gòu)建了慢病毒載體pLV-CMV-RFP-GFP-LC3，經(jīng)感染和嘌呤霉素篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)RFP-GFP-LC3的RFP-GFP-LC3-RAW264.7細(xì)胞;
　　2.SapM和饑餓均導(dǎo)致GFP-LC3斑點(diǎn)增多和LC3Ⅱ水平增高，在SapM處理的細(xì)胞中加入氯喹并沒有引起LC3Ⅱ的進(jìn)一步升高。
　　3.siRab7處理后，細(xì)胞P62水平顯著增高;免疫組化顯示SapM與Rab