水稻紫色酸性磷酸酶Ia亞家族基因的功能研究.pdf

1、磷是植物體生長發(fā)育所必需的大量元素之一，但植物的根系只能吸收無機磷，為了克服土壤無機磷的不足，作物生長時需要施用大量的磷肥來滿足生長所需。施用化學(xué)磷肥不僅極大地加重了農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)成本，而且直接導(dǎo)致水系富營養(yǎng)化而污染環(huán)境。由于長期過量施用磷肥，土壤中已經(jīng)積累了一個巨大的潛在磷庫，提高作物活化和自身利用土壤磷庫的能力，使土壤磷庫成為磷礦的替代資源，具有重大的生態(tài)與經(jīng)濟(jì)意義。當(dāng)植物體處于缺磷時，植物體會發(fā)生一系列的應(yīng)激反應(yīng)，包括根構(gòu)型的改變、磷

2、信號途徑的改變、體內(nèi)磷代謝的改變和紫色酸性磷酸酶（Purple Acid Phosphatase，PAP）的分泌，其中紫色酸性磷酸酶的分泌可以幫助植物將不能吸收的有機磷轉(zhuǎn)換可吸收態(tài)的無機磷，從而緩解植株的缺磷狀況。本課題主要利用反向遺傳學(xué)的技術(shù)，對水稻紫色酸性磷酸酶(Ⅰ)a亞家族中2個受缺磷強烈誘導(dǎo)的基因OsPAP10a和OsPAP10c進(jìn)行表達(dá)調(diào)控與功能分析。
　　 定量RT-PCR分析表明，OsPAP10a基因在地上部分和根

3、部的表達(dá)均受缺磷誘導(dǎo)，而OsPAP10c只在根部受缺磷特異誘導(dǎo)表達(dá)。利用OsPHR2超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株、pho2突變體、OsSPX1的抑制表達(dá)材料，對OsPAP10a和OsPAP10c兩個基因在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的表達(dá)進(jìn)行分析，結(jié)果表明OsPAP10a和OsPAP10c基因的表達(dá)受到OsPHR2、OsPHO2和OsSPX1的調(diào)控。
　　 植株根部總蛋白經(jīng)非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離及磷酸酶活性染色后，清晰地獲得了3個酸性磷酸酶同

4、工酶，分別為E1，E2，E3。其中E1所含的蛋白受缺磷顯著誘導(dǎo)。通過蛋白質(zhì)譜技術(shù)，對E1條帶的蛋白進(jìn)行分離獲得了OsPAP10a，OsPAP10c二種紫色酸性磷酸酶，其中OsPAP10c蛋白量在缺磷的野生型植株根系的誘導(dǎo)豐度顯著高于OsPAP10a。
　　 利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，在水稻中超表達(dá)OsPAP10a的全長cDNA，獲得16個OsPAP10a超表達(dá)植株，通過半定量RT-PCR分析后篩選了其中2個表達(dá)量高、遺傳穩(wěn)定的

5、轉(zhuǎn)基因株系Oe1和Oe2。植株酸性磷酸酶活性測定表明，缺磷條件下，對照及轉(zhuǎn)基因水稻植株地上部分和根部的酸性磷酸酶活性、BCIP染色等都得到了顯著的提高。轉(zhuǎn)基因株系根表面酸性磷酸酶活性又顯著地高于對照，說明超表達(dá)OsPAP10a顯著地提高了水稻根表面的分泌性酸性磷酸酶活性。當(dāng)以0.5mM ATP作為外界唯一的磷源時，生長有轉(zhuǎn)基因植株的培養(yǎng)液中無機磷濃度顯著地高于培養(yǎng)對照植株的培養(yǎng)液;同時，轉(zhuǎn)基因植物體內(nèi)總磷含量也顯著地高于對照，證明超表達(dá)

6、OsPAP10a的轉(zhuǎn)基因水稻能很好地利用培養(yǎng)液中的ATP合成自身能吸收的無機磷。在土培實驗中，超表達(dá)OsPAP10a的轉(zhuǎn)基因水稻長勢顯著優(yōu)于野生型植株，抽穗提前并具有更多的分蘗數(shù)
　　 OsPAP10c超表達(dá)材料10c-Oe1，10c-Oe4的根表面酸性磷酸酶活性定性（BCIP染色）和定量（根表面酸性磷酸酶活性測定）的分析結(jié)果表明，與OsPAP10a蛋白一樣，OsPAP10c具有外分泌的活性，而OsPAP10c蛋白的外分泌活性明