裂褶菌凝集素、酸性磷酸酶、溶血素的純化及其生化特性的研究.pdf

1、中國農業(yè)大學博士學位論文裂褶菌凝集素、酸性磷酸酶、溶血素的純化及其生化特性的研究姓名：韓春華申請學位級別：博士專業(yè)：微生物學指導教師：王賀祥20060601A b s t r a c tS c h i z o p h y l h a nc o m m u n ei s a l l e d i b l e m u s h r o o mw i t h h i g l l m e d i c i n a l v a l u e ．A n e

2、 u t r a l g l y c a nd e s i g n a t e ds c h i z o p h y l l a nt h a t C a l lp o t e n ta u g m e n t t h ei m m u n i t y h a sb e e n i s o l a t e da n da p p l i e dt oc l i n i c a lm e d i c i n e ．U s i n g a

3、p r o c e d u r e w h i c h i n v o l v e d a m m o n i u m s u l f a t e p r e c i p i t a t i o n ，i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y o nD E A E - c e l l u l o s e ，C M —c e l l u l o s e ，Q - S e p h a

4、r o s ea n dg e lf i l t r a t i o nb y f a s tp r o t e i nl i q u i dc h r o m a t o g r a p h y o nS u p e r d e x7 5 ，l e c t i n ，a c i dp h o s p h a t a s e ，h e m o l y s i nw e r ei s o l a t e df r o m f r e s

5、hf r u i t i n gb o d i e so ft h es p l i tg i l lm u s h r o o m sc o m m u n e ．T h el e e r i n w a s a h o m o d i m e r i c l a c t o s e - b i n d i n g l e c t i n w i t h a m o l e c u l a r m a s s o f6 4 k D a

6、 ．T h eN - t e r m i n a ls e q u e n c eo ft h el e c t i n ，A P P N F P L L V P G N D K L L A V I S A M T P ，w a ss i m i l a rt o a p a r to ft h es e q u e n c et h ec e l ld i v i s i o np r o t e i nf r o mG l e o

7、b a c t e rv i o l a c e u s ，t oF e l i n ei n h i b i na s u b u n i tp r e c u r s o ra n dt ol e c t i nL Z 一8f r o mG a n o d e r m al u c i d u m ．T h eh e m a g g l u t i n a t i n ga c t i v i t yo ft h el e c t

8、i nw a si n h i b i t e db yi n u l i n a n d l a c t o s e ．T h e h e m a g g l u t i n a t i n g a c t i v i t y w a s s t a b l e a tt e m p e r a t u r e s u p t o 4 0 ℃，a n di nc o n c e n t r a t i o n so fN a O Ha

9、 n dH C Is o l u t i o nu pt o 1 2 ．5 a n d2 5m M ，r e s p e c t i v e l y ．T h el e c t i n e x h i b i t e dp o t e n tm i t o g e n i ca c t i v i t yt o w a r dm o u s es p l e n o c y t e s ，a n t i p r o l i f e r

10、a t i v ea c t i v i t yt o w a r dt u m o rc e l l l i n e s ，a n d i n h i b i t o r ya c t i v i t yt o w a r dH I V - 1 r e v e r s et r a n s c r i p t a s e ．I tw a s d e v o i do fa n t i f u n g a la c t i v i t

11、y ．T h el i f es p a n o fm o u s et h a tw a si n o c u l a t e d t u m o u rc e l l s w a sp r o l o n g e d ，a n d t h eb o d yw e i g h ti n c r e a s ew a ss l o w e dd o w n b yi n j e c t i o no f S ．e o r n l n u

12、 n el e c t i n ．T h e a c i dp h o s p h a t a s ew h i c h w a sm o n o m e r w i t hm o l e c u l a rw e i g h t o f7 2 ．5 k D ai nS D S —P A G E w a sb e e n d e t e c t e d a n d p u r i f i e d f r o m 置c o m m u n

13、 e ．T h e N - t e r m i n a l s e q u e n c e o f t h e A C P w a sN A P ( T ) W A Q I D E V ．I td e m o n s t r a t e st h a t t h ep Ho p t i m u mf o rt h ee n z y m ei s 4 ．6 a n d t h et e m p e r a t u r eo p t i m

14、 u m i s 5 0 2 2 ．T h e s u b s t a n t i a la c t i v i t y o f A C P f r o m J s ．c o m m u n er e m a i n s t e m p e r a t u r e 2 0 “ C ．5 0 ' Ca n dp H4 - 9 ．T h e c a t i o no fH 9 2 + 、C u 2 + 、F e “a n dA 1

15、3 + c a ns t r o n g l yi n h i b i t t h e a c t i v i t y ．F e 2 + w i t ht h ec o n c e n t r a t i o n o f l O m Mc a l l a b s o l u t e l yi n h i b i t t h eA C Pa c t i v i t y ．U n d e r t h e o p t i m a lc o n

16、 d i t i o n s ，t h ea p p a r e n tK mv a l u eo ft h e p u r i f i e de n z y m et o w a r dp a r a n i t r o p h e m y l p h o s p h a t e ( p - N P P ) w a s0 ．2 4 8 m Ma n dV m a x w a s 9 ．0 9 3 x 1 0 。3 # r e e l

17、／r a i n ．T h eh e m o l y s i no f ＆c o m m u n e w a s am o n o m e r i c p r o t e i n w i t hn a t u r a lm o l e c u l a r m a s s o f2 9 k D a ．T h eN —t e r m i n a l s e q u e n c ew a sA T N Y N K C P G Aa n d w

18、 a sn o t s i m i l a r i t y t o o t h e r h e m o l y s i nw h i c h w a sr e p o r t e dp r e v i o u s l y ．H e m o l y s i na c t i v i t yw a ss u s c e p t i v et ot e m p e r a t u r ea n dp H ．T h es u b s t a n

19、 t i a la c t i v i t yo fh e m o l y s i nf r o m Sc o m m u n er e m a i n st e m p e r a t u r e2 0 0 C 一4 0 ℃a n dp H5 ．5 —6 ．5 ．T h eb i v a l e n c ec a t i o nH 9 2 + a n dC u “c a ns t r o n g l y p r o d u c ei

20、n h i b i t i n ga b i l i t y o nh e m o l y s i na c t i v i t y ．T h eh e m o l y s i nw a sn o ts e n s i t i v et o p r o t e a s e i n h i b i t o rP M S E D T T c a nd i s t i n c t l yi n h i b i tt h e a c t i v

21、 i t y ．T h eh a e m o l y t i ca c t i v i t yw a ss t r o n g l yi n h i b i t e db ys u c r o s ea n dr a f f i n o s eh y d r a t ea n ds l i g h t l ya u g m e n t e d b ym a n n o s e ，m e l i b i o s ea n d 舀u c o