水稻紫色酸性磷酸酶OsPAP10a和OsPAP10c的功能研究.pdf

1、磷是植物生長發(fā)育所必需的大量元素之一。自然界中磷含量相當(dāng)豐富，但大部分以有機(jī)磷化合物形式存在，能被植物直接吸收利用的無機(jī)磷含量常常低于植物生長所需的濃度，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中需要大量施用磷肥來實現(xiàn)作物高產(chǎn)。但磷肥的過度使用，不僅增加了生產(chǎn)成本，也是水體富營養(yǎng)化的重要成因。提高作物的磷養(yǎng)分吸收效率，對農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的意義重大。
　　缺磷條件下，植物能合成并向根外分泌紫色酸性磷酸酶(Purple acidphosphatases，PAPs)，從

2、而水解植物根部周圍的有機(jī)磷化合物，釋放出無機(jī)磷供植物生長所需。研究表明，PAP Ia亞家族在植物有機(jī)磷的利用及缺磷適應(yīng)中具有重要作用。水稻PAP Ia亞家族包括OsPAP10a、OsPAP10b、OsPAP10c、OsPAP10d和OsPAP26。定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)分析顯示，Os PAP10a在地上部分和地下部分均受缺磷特異誘導(dǎo)，而Os PAP10c只在地下部分受缺磷特異誘導(dǎo)。OsPAP10b和OsPAP10d在各組織和

3、各個發(fā)育時期表達(dá)都很低，而OsPAP26在各個組織中均有較高的表達(dá)。本研究主要對象是PAP Ia亞家族的OsPAP10a和OsPAP10c的功能。
　　通過構(gòu)建OsPA尸10a和Os PAP10c啟動子融合GUS報告基因的載體并利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因技術(shù)迸行遺傳轉(zhuǎn)化，研究獲得了OsPAP10a和Os PAP10c啟動子融合GUS報告基因轉(zhuǎn)基因株系。轉(zhuǎn)基因植株的GUS染色分析證實了OsPAP10a在地上部分和地下部分均受缺磷特異誘導(dǎo)，

4、而OsPAP10c只在地下部分受缺磷特異誘導(dǎo)。根部切片顯示，OsPAP10a和Os PAP10c主要表達(dá)于根的表皮和外皮層，OsPAP10c在葉、幼穗和花粉中都有表達(dá)。
　　根表面酸性磷酸酶(Acid Phosphatase，APase)活性定性染色（BCIP染色）結(jié)果表明，OsPAP10a和Os PAP10c超表達(dá)株系根表面的染色增強(qiáng)，但超表達(dá)OsPAP10c的轉(zhuǎn)基因株系根表面的染色深于超表達(dá)Os PAP10a的轉(zhuǎn)基因株系。利用

5、APase活性定量分析，檢測了植物根表面、植物地上和地下部分組織中、及懸浮細(xì)胞培養(yǎng)的介質(zhì)（水培液）中的APase活性。結(jié)果表明，與野生型(Wild Type，WT)植株相比，超表達(dá)OsPAP10c使根表面APase活性增加約10倍，而超表達(dá)OsPAP10a使根表面APase活性僅增加2倍;OsPAP10c超表達(dá)株系地上和地下部分組織中APase活性增加約5倍，而OsPAP10a超表達(dá)材料僅增加1.5-2倍;在供磷條件下，超表達(dá)OsPAP

6、10a的轉(zhuǎn)基因懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中的APase活性較其野生型對照提高了近2倍，而超表達(dá)OsPAP10c使懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中的PAP酶活提高了10倍以上。可見，OsPAP10c在水稻中較OsPAP10a具有更顯著的功能和應(yīng)用潛力。
　　植株地上和地下部分組織的總蛋白經(jīng)非變性的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離及APase活性染色后，清晰地獲得了APase同工酶的條帶。結(jié)果表明，Os PAP10a超表達(dá)株系增加A2條帶活性。OsPAP10c超表達(dá)株系誘

7、導(dǎo)A1、A3、A4和A5條帶?；钚阅z染色和Western蛋白印跡分析懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液中的蛋白發(fā)現(xiàn)，OsPAP10c在水稻細(xì)胞中主要分泌到細(xì)胞外，因而在培養(yǎng)液中大量存在。
　　為了明確OsPAP10a和Os PAP10c基因在培育磷養(yǎng)分高效水稻品種中的應(yīng)用前景，研究還對二基因的超表達(dá)株系進(jìn)行了有機(jī)磷(ATP)降解實驗。結(jié)果表明，OsPAP10c超表達(dá)株系能顯著提高ATP降解速率及利用效率。在只添加有機(jī)磷的水培溶液培養(yǎng)5天時，野生型葉片