早期分泌型抗原靶6(ESAT6)抑制小鼠巨噬細胞自噬的研究.pdf

1、目的:早期分泌型抗原靶6能夠通過激活哺乳動物雷帕霉素靶蛋白抑制自噬的作用，從而促進卡介苗的生長增殖，研究ESAT6對溶酶體與自噬小體的融合之間的相互作用關系，為EAST6介導的免疫逃逸機制提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.對轉染不同時間pCMV-HA-ESAT6質粒的RAW264.7細胞，進行細胞裂解，BCA法測蛋白濃度，蛋白免疫印記（Western Blot）法檢測細胞LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的量。然后對轉染pCMV-HA-E

2、SAT6重組質粒、氯喹(CQ)、pCMV-HA對照質粒和CQ與pCMV-HA-ESAT6轉染聯(lián)合處理條件下的RFP-GFP-LC3-RAW264.7小鼠巨噬細胞，熒光顯微鏡下記錄結果，并用計算機軟件計數(shù);進行細胞裂解，用BCA法測蛋白濃度，蛋白免疫印記（Western Blot）法檢測LC3Ⅱ、LC3Ⅰ的量。
　　2.對EBSS（Earle平衡鹽溶液）以及轉染pCMV-HA-ESAT6重組質粒、pCMV-HA對照質粒處理的RAW2

3、64.7細胞進行細胞裂解，然后接種于羅琴培養(yǎng)基上，觀察BCG的生長情況。然后對轉染pCMV-HA-ESAT6重組質粒、氯喹(CQ)、pCMV-HA對照質粒和CQ與pCMV-HA-ESAT6轉染聯(lián)合處理條件下的RAW264.7小鼠巨噬細胞，進行細胞裂解，接種于羅琴培養(yǎng)基上，觀察BCG的生長情況。
　　3.對轉染pCMV-HA-ESAT6的小鼠巨噬細胞(RAW264.7)，進行細胞裂解，測蛋白濃度，用Western Blot的方法檢測

4、LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、p-mTOR、p-70S6K、p62的蛋白水平。然后用mTOR的抑制劑Torin1和ESAT6共同處理RAW264.7，用LysoTracker Red染色溶酶體，并用計算機軟件計數(shù)溶酶體的數(shù)量;用蛋白免疫印記法檢測p-70S6K、p62、p-mTOR的量;對細胞進行裂解后進行BCG的培養(yǎng)。
　　結果:
　　1.轉染ESAT6質粒的RAW264.7細胞隨著時間的延長，LC3Ⅱ的水平逐漸增加，對用ESAT6

5、和CQ處理的三組RAW264.7小鼠巨噬細胞，其LC3Ⅱ的量相差不多，組間無統(tǒng)計學意義，但都高于對照組，熒光顯微鏡結果顯示，ESAT6和CQ處理組自噬體數(shù)目差不多，但都高于對照組;
　　2.經(jīng)EBSS處理的BCG的生長較對照組減少，經(jīng)ESAT6處理的BCG的生長較對照組增加;經(jīng)CQ以及ESAT6處理的BCG生長都較對照組增加，且三組生長水平差不多。
　　3.經(jīng)轉染ESAT6的RAW264.7細胞，免疫印記結果顯示，LC3Ⅱ、

6、p-mTOR、p-70S6K、p62的水平都較對照組增加;經(jīng)ESAT6和Torin1處理的RAW264.7細胞Western Blot結果顯示p62和p-mTOR的量比ESAT6單獨處理時減少，LysoTracker Red染料法結果顯示在Torin1單獨存在或與ESAT6共同存在時，恢復了ESAT6單獨處理時所致的染色減少;BCG結果顯示在Torin1單獨存在或與ESAT6共同存在時，BCG的生長情況都較ESAT6單獨處理時減少。