結(jié)核分枝桿菌抗原蛋白ESAT6與rdESAT6在畢赤酵母中的克隆表達(dá)及其在結(jié)核早期診斷中的應(yīng)用.pdf

1、ESAT6(6kD early secreted antigenic target)，即早期分泌抗原靶，存在于結(jié)核分枝桿菌(MTB，Mycobacterium tuberculosis)的早期培養(yǎng)濾液中，是一種小分子量的分泌蛋白，因?yàn)槠鋬H存在于MTB等致病性分枝桿菌而卡介苗(BCG)等非致病性分枝桿菌缺乏，并且能夠有效的誘導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)，所以可以作為結(jié)核病早期診斷的特異性抗原之一。rdESAT6(recombinant dimer ES

2、AT6)為ESAT6的重組二聚體，因?yàn)槠渚哂懈嗟姆磻?yīng)表位，所以表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗原性?，F(xiàn)有的大腸桿菌(E.coli)與恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)表達(dá)系統(tǒng)，只能得到包涵體形式的rdESAT6蛋白，在提純過程中需經(jīng)過變性與復(fù)性過程，操作復(fù)雜且不利于臨床應(yīng)用。本文采用畢赤酵母分泌型表達(dá)系統(tǒng)，得到可溶性的具有接近天然結(jié)構(gòu)形態(tài)的rdESAT6抗原。
　　 目的：
　　 構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)結(jié)核分枝桿菌分泌性抗原ES

3、AT6與rdESAT6，得到可溶性的具有接近天然結(jié)構(gòu)的蛋白抗原，并研究其作為抗原刺激物在結(jié)核病早期診斷中的應(yīng)用。
　　 方法：
　　 用PCR技術(shù)擴(kuò)增結(jié)核分枝桿菌抗原基因esat6及rdesat6，分別克隆到pPic9k載體中，通過電轉(zhuǎn)化重組到畢赤酵母基因組并進(jìn)行表達(dá)。采用鎳柱(Ni-NTA)純化目的蛋白。取重組BCG免疫后的小鼠脾臟淋巴細(xì)胞，以大腸桿菌、恥垢分枝桿菌與畢赤酵母表達(dá)的同一抗原rdESAT6分別為抗原刺激物

4、進(jìn)行酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)(ELISPOT)，并分析其刺激細(xì)胞產(chǎn)生γ-干擾素(IFN-γ)的能力。
　　 結(jié)果：
　　 采用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了ESAT6與rdESAT6蛋白抗原，ESAT6的產(chǎn)量低且難以純化，以Ni-NTA親和層析成功純化得到高純度的rdESAT6蛋白。rdESAT6在分泌表達(dá)過程中被糖基化導(dǎo)致分子量偏高，采用糖苷內(nèi)切酶H(Endo H)消化后，分子量為24kD，經(jīng)Western Blot鑒定可與相