結(jié)核分枝菌CFP10-ESAT6融合蛋白的真核表達(dá)及其在牛結(jié)核病檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、牛結(jié)核病(Bovinetuberculosis,bTB)是一種主要由牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)引起的人獸共患傳染病。該病在全球范圍內(nèi)的流行，對(duì)公共衛(wèi)生造成嚴(yán)重的影響，也使經(jīng)濟(jì)遭受重大損失。很多國(guó)家對(duì)牛結(jié)核的控制主要基于“檢疫-撲殺”的防控策略。盡管全球大范圍地對(duì)牛結(jié)核采取控制措施，但對(duì)其根除仍十分困難，某些官方宣布根除的國(guó)家依然檢測(cè)到該病的存在。
　　 鑒于分枝桿菌感染初期機(jī)體的免疫應(yīng)答主要以細(xì)胞免疫為主

2、，故對(duì)牛結(jié)核監(jiān)測(cè)和預(yù)防控制主要是以細(xì)胞免疫應(yīng)答(CMI)為基礎(chǔ)的檢測(cè)手段，包括結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)(TST)和γ-干擾素(IFN-γ)檢測(cè)試驗(yàn)。其中應(yīng)用最普遍的檢測(cè)方法是結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)，但是其檢測(cè)效果受限于敏感性和特異性。IFN-γ檢測(cè)在很多國(guó)家被應(yīng)用，該方法主要檢測(cè)特異性抗原體外刺激全血后產(chǎn)生的IFN-γ水平。在實(shí)際應(yīng)用中IFN-γ檢測(cè)主要是作為結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)的輔助檢測(cè)手段。這兩種方法使用的結(jié)核菌素純化蛋白衍生物(puri

3、fiedproteinderivative，PPD)是由分枝桿菌培養(yǎng)物滅活提純得到，成分比較復(fù)雜，作為檢測(cè)抗原其特異性易受交叉反應(yīng)影響。CFP10和ESAT6是結(jié)核分枝桿菌特異蛋白，其編碼基因僅存在于致病性分枝桿菌中，禽結(jié)核、副結(jié)核等非致病分枝桿菌則不含有這兩種基因，因此，這兩種蛋白是良好的牛結(jié)核病診斷候選抗原。本研究應(yīng)用畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并初步純化了CFP10-ESAT6蛋白，并對(duì)其在牛結(jié)核病檢測(cè)中的應(yīng)用進(jìn)行了評(píng)價(jià)。
　　

4、 1.結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白的真核表達(dá)和鑒定
　　 PCR擴(kuò)增獲得cfp10-esat6融合基因，經(jīng)篩選和測(cè)序鑒定正確后，克隆到pPICZαA表達(dá)載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pPICZαA-(cfp10-esat6)，將其轉(zhuǎn)入畢赤酵母菌GS115。重組菌經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，采用親和層析的方法純化酵母培養(yǎng)液上清，SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果顯示33KD的目的蛋白被成功分泌表達(dá)。Westernblot結(jié)果顯示，CFP10-ESAT

5、6融合蛋白可以分別與抗CFP10單抗和抗ESAT6單抗發(fā)生特異性反應(yīng)，顯示其具有較好的免疫反應(yīng)性。經(jīng)測(cè)定在最佳表達(dá)條件下酵母培養(yǎng)液上清中總蛋白量為25.2mg/L，采用親和層析初步純化后目的蛋白產(chǎn)量為18.3mg/L。
　　 2.結(jié)核分枝桿菌CFP10-ESAT6融合蛋白在牛結(jié)核病診斷中的初步應(yīng)用
　　 將畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的CFP10-ESAT6融合蛋白和大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的該蛋白分別用于皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)，檢測(cè)

6、陽(yáng)性率低于同步進(jìn)行的比較變態(tài)試驗(yàn)，說(shuō)明應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌特異性蛋白CFP10-ESAT6的皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)結(jié)果的假陽(yáng)性低于比較變態(tài)試驗(yàn)。將融合蛋白皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)結(jié)果與比較變態(tài)試驗(yàn)結(jié)果作比較，結(jié)果顯示真核表達(dá)的CFP10-ESAT6融合蛋白皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)符合率(59.3％)高于原核表達(dá)的該蛋白(49.4％)，尤其是對(duì)于比較變態(tài)試驗(yàn)結(jié)果為陰性的個(gè)體，真核表達(dá)的CFP10-ESAT6融合蛋白皮內(nèi)變態(tài)試驗(yàn)結(jié)果與之符合率(83.3％)顯著高于原核表達(dá)的該蛋

7、白(54.5％)，顯示出較高的特異性。
　　 在牛結(jié)核病低陽(yáng)性率牛群的IFN-γELISA檢測(cè)試驗(yàn)中，以CFP10-ESAT6融合蛋白作為刺激原的檢測(cè)結(jié)果與PPD刺激的檢測(cè)結(jié)果符合率較高(97.6％)。對(duì)于牛結(jié)核病高陽(yáng)性率牛群，將CFP10-ESAT6融合蛋白作為刺激原進(jìn)行牛結(jié)核IFN-γ檢測(cè)試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果與PPD作為刺激原的IFN-γ檢測(cè)結(jié)果相比較，以真核表達(dá)的CFP10-ESAT6融合蛋白為刺激原的IFN-γ檢測(cè)結(jié)果符合率(