AMPK-p70s6k信號(hào)通路在布魯菌誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬中的作用研究.pdf

1、布魯菌?。˙rucellosis）是由布魯菌（Brucella）感染引發(fā)的一種人畜共患傳染性疾病。布魯菌為革蘭染色陰性的兼性胞內(nèi)寄生菌，巨噬細(xì)胞是其生存和繁殖的靶細(xì)胞，它主要通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞自噬得以在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期生存繁殖。已有研究表明AMPK/p70s6k信號(hào)通路不僅參與細(xì)胞凋亡、自噬等多種細(xì)胞活動(dòng)，還與病原體在細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖密切相關(guān)。
　　目的：
　　本研究擬通過(guò)建立羊種布魯菌16M（16M）體外感染小鼠巨噬

2、細(xì)胞RAW264.7（RAW264.7）實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停接慉MPK/p70s6k信號(hào)通路對(duì)布魯菌胞內(nèi)生存繁殖以及布魯菌介導(dǎo)細(xì)胞自噬的影響，從而揭示布魯菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的持續(xù)感染與AMPK/p70s6k信號(hào)通路密切相關(guān)。
　　方法：
　　1.建立16M體外感染RAW264.7細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，?yīng)用Western blot技術(shù)檢測(cè)不同時(shí)間段RAW264.7細(xì)胞內(nèi)p-AMPK(Thr172)和p-p70s6k(Thr389)的表達(dá)量變化。

3、
　　2. AMPK抑制劑Compound C（CC）與RAW264.7細(xì)胞共同孵育1h，然后，用16M侵染RAW264.7細(xì)胞，未經(jīng)Compound C處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，感染4h、8h、12h、24h和48h后通過(guò)布魯菌的CFU計(jì)數(shù)檢測(cè)布魯菌胞內(nèi)存活情況；Western blot技術(shù)檢測(cè)AMPK抑制劑Compound C對(duì)16M介導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞內(nèi)p-AMPK(Thr172)和p-p70s6k(Thr389)表達(dá)的抑制

4、效果。
　　3.抑制劑Compound C與RAW264.7細(xì)胞共同孵育1h，然后，用16M侵染RAW264.7細(xì)胞，未經(jīng)抑制劑Compound C處理的細(xì)胞作為對(duì)照組，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot檢測(cè)自噬相關(guān)基因LC3-II/LC3-I轉(zhuǎn)換率、Beclin1和ULK1的表達(dá)。
　　4.采用小分子干擾RNA(siRNA)軟件設(shè)計(jì)3對(duì)針對(duì)AMPKα2基因不同位點(diǎn)的siRNA片段，由公司合成

5、此siRNA片段，將特異性siRNA經(jīng)轉(zhuǎn)染試劑siRNA-mate介導(dǎo)轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞內(nèi)，24h后收集細(xì)胞，分別采用qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測(cè)AMPKα2的 mRNA和蛋白表達(dá)情況，分析對(duì)應(yīng)不同位點(diǎn)的三對(duì)特異性siRNA片段對(duì)AMPKα2的沉默效果，篩選出實(shí)驗(yàn)所需干擾效果最好的AMPKα2-siRNA片段。
　　5.將干擾效果最好的siRNA片段轉(zhuǎn)染至RAW264.7細(xì)胞內(nèi)，6h后用16M侵染RAW

6、264.7細(xì)胞，未轉(zhuǎn)染AMPKα2-siRNA片段的細(xì)胞和轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照片段（NC）的細(xì)胞作為對(duì)照組，利用CFU計(jì)數(shù)法檢測(cè)16M在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的生存繁殖能力；利用qRT-PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin1和ULK1的mRNA和蛋白表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.16M侵染RAW264.7細(xì)胞后，p-AMPK(Thr172)在第2h表達(dá)量最高（P<0.05），在第8h、12h和24h

7、其表達(dá)水平恢復(fù)正常，與對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P>0.05），p-p70s6k(Thr389)的表達(dá)量在各時(shí)間點(diǎn)均低于對(duì)照組（P<0.05），自噬相關(guān)蛋白Beclin1和ULK1的表達(dá)顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。
　　2.在4h、8h、12h、24h和48h，經(jīng)抑制劑Compound C處理過(guò)的RAW264.7細(xì)胞內(nèi)16M數(shù)目顯著低于對(duì)照組細(xì)胞（P<0.05）。
　　3.在12h和24h，16M+CC組細(xì)胞中的p-AMPK

8、(Thr172)、LC3-II/LC3-I轉(zhuǎn)換率、Beclin1和ULK1的蛋白水平顯著低于16M組細(xì)胞（P<0.01），p-p70s6k(Thr389)的蛋白表達(dá)高于16M組細(xì)胞（P<0.01），16M+CC組細(xì)胞中Beclin1和ULK1的mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于16M組細(xì)胞（P<0.01）。
　　4.與正常組、siRNA-mate組和NC組相比，構(gòu)建的特異性siRNA片段能有效降低RAW264.7細(xì)胞內(nèi)AMPK的mRNA和

9、蛋白表達(dá)水平，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。對(duì)應(yīng)不同位點(diǎn)的三對(duì)siRNA片段，其中AMPKα2-865-siRNA對(duì)AMPK mRNA和蛋白表達(dá)量的抑制效果最強(qiáng)。
　　5.分別在12h和24h，沉默AMPKα2基因細(xì)胞組內(nèi)16M數(shù)目顯著低于空白對(duì)照組和NC細(xì)胞組（P<0.01）；沉默AMPKα2基因后，分別在12h和24h細(xì)胞內(nèi)的p-AMPK(Thr172)、LC3-II/LC3-I的轉(zhuǎn)換率、Beclin1和ULK1的蛋白水

10、平顯著低于16M組細(xì)胞（P<0.01），p-p70s6k(Thr389)的蛋白表達(dá)高于16M組細(xì)胞（P<0.01），Beclin1和ULK1的 mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著低于16M組細(xì)胞（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　1.布魯菌16M可以激活RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的AMPK/p70s6k信號(hào)通路。
　　2.抑制劑Compound C可顯著降低16M在RAW264.7細(xì)胞內(nèi)的存活。
　　3.抑制劑Compound