VSV G跨膜區(qū)在融合過(guò)程中的作用機(jī)制研究及亞硒酸鈉通過(guò)p70S6K-p53-ULK1通路誘導(dǎo)ROS上調(diào)抑制保護(hù)性自噬.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分
　　膜融合是一種重要的生命現(xiàn)象，參與多種細(xì)胞活動(dòng)，包括細(xì)胞融合，囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)，細(xì)胞器的動(dòng)態(tài)變化以及病毒感染。幾乎所有這些活動(dòng)都是由一類特殊的膜蛋白——膜融合蛋白（也稱為融合原）所介導(dǎo)的。廣為熟知的融合蛋白是介導(dǎo)囊泡融合的SNARE復(fù)合物，在過(guò)去二十年中其作用機(jī)制已經(jīng)得到深入揭示。另一種重要的融合事件是包膜病毒的融合，這是由病毒融合蛋白所介導(dǎo)的。病毒融合蛋白定位在病毒的包膜上，控制病毒

2、感染的關(guān)鍵步驟——病毒包膜與宿主細(xì)胞膜的融合。
　　不同的融合蛋白誘導(dǎo)膜融合的物理過(guò)程基本相同，但具體機(jī)制卻大不相同。與SNARE復(fù)合物不同，病毒融合蛋白的構(gòu)象復(fù)雜得多，這也決定了其融合機(jī)制更為復(fù)雜。在本研究中，關(guān)注水泡型口炎病毒的融合蛋白G蛋白的跨膜區(qū)在融合中的作用機(jī)制。構(gòu)建了一套新的細(xì)胞-細(xì)胞融合系統(tǒng)，方便對(duì)VSV G介導(dǎo)的融合時(shí)間進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控以及定量分析。根據(jù)這套實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)VSV G能夠在1-2min的時(shí)間內(nèi)迅速介導(dǎo)細(xì)胞

3、融合。為了研究跨膜區(qū)的功能，將VSV G的跨膜區(qū)替換成了其他融合蛋白的跨膜區(qū)。結(jié)果顯示跨膜區(qū)的替換會(huì)顯著降低VSV G的融合效率及其介導(dǎo)的慢病毒感染效率。由于VSV G的胞外結(jié)構(gòu)域并未改變，僅是其跨膜區(qū)被替代，推測(cè)G蛋白仍能正常起始融合過(guò)程，但是融合可能會(huì)被阻斷在半融合狀態(tài)，而不能進(jìn)一步完成完全融合。為了驗(yàn)證假設(shè)，構(gòu)建了另一套細(xì)胞-細(xì)胞融合實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。發(fā)現(xiàn)跨膜區(qū)的替換能夠?qū)⑷诤鲜录钄嘣诎肴诤想A段。最后，對(duì)VSV G跨膜區(qū)中影響融合的關(guān)鍵

4、氨基酸進(jìn)行了篩選，并指出VSV G跨膜區(qū)在融合中的作用具有序列依賴性。
　　本研究中，發(fā)現(xiàn)VSV G的跨膜區(qū)對(duì)于其融合能力至關(guān)重要?？缒^(qū)替換后融合過(guò)程被阻斷在了半融合階段。研究工作為以后融合機(jī)制的研究提供了一些新的研究策略，更重要的是為抗病毒預(yù)防和治療提供新的靶點(diǎn)。
　　第二部分
　　硒是人體所必需的微量元素，對(duì)身體健康、腫瘤的預(yù)防以及治療都有重要作用。大量證據(jù)表明，超營(yíng)養(yǎng)劑量的硒能夠誘導(dǎo)包括前列腺癌，膀胱癌，甲狀腺

5、癌，食管肝癌，結(jié)腸癌，肺癌以及白血病等多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。因此，研究亞硒酸鈉誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制可以為含硒藥物的研發(fā)以及白血病的治療提供理論依據(jù)，并具有重要意義。
　　本課題以白血病NB4細(xì)胞為研究對(duì)象，研究亞硒酸鈉抑制NB4細(xì)胞保護(hù)性自噬和誘發(fā)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制。首先通過(guò)免疫熒光實(shí)驗(yàn)以及電鏡觀察驗(yàn)證了超營(yíng)養(yǎng)劑量的亞硒酸鈉處理NB4細(xì)胞后，自噬發(fā)生顯著下調(diào)，采用流式細(xì)胞術(shù)分析也證實(shí)的前面的結(jié)果，即亞硒酸鈉誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在對(duì)

6、細(xì)胞內(nèi)活性氧水平進(jìn)行檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉處理后活性氧水平顯著上調(diào)，在活性氧清除劑處理后亞硒酸鈉對(duì)自噬的抑制作用得以逆轉(zhuǎn)。因此推測(cè)亞硒酸鈉對(duì)自噬的抑制作用與活性氧的有關(guān)。
　　進(jìn)一步的機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)亞硒酸鈉誘導(dǎo)的活性氧對(duì)自噬的抑制是由ULK1的下調(diào)介導(dǎo)的。通過(guò)ChIP實(shí)驗(yàn)證明p-p53(Ser392)對(duì)ULK1進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)。而在對(duì)p53的激酶進(jìn)行篩查后發(fā)現(xiàn)p70S6K可以使p53Ser392位磷酸化進(jìn)而調(diào)控ULK1表達(dá)，實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的控