p53在白藜蘆醇誘導人結(jié)腸癌HCT-116細胞自噬和凋亡過程中的作用.pdf

1、目的:
　　白藜蘆醇(RSV;3，4'，5-trihydroxystilbene)是一種天然的植物抗毒素，具有抑制腫瘤細胞增殖的作用，并且能夠通過誘導腫瘤細胞發(fā)生凋亡或自噬進而發(fā)揮抗腫瘤作用。多篇報道表明腫瘤抑制基因p53能夠調(diào)節(jié)細胞凋亡和自噬，但由于條件差異p53對細胞凋亡和自噬的作用不同。本實驗以人結(jié)腸癌細胞株HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞作為研究對象，通過多種實驗方法，研究p53在白藜蘆醇誘導結(jié)腸

2、癌細胞自噬和凋亡過程中的作用，為結(jié)腸癌細胞自噬和凋亡機制研究提供新的理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.MTT法檢測不同濃度白藜蘆醇(0μM，25μM，50μM，100μM，150μM，200μM)作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞24 h、48h、72h后細胞生存率變化。
　　2.單丹磺酰戊二胺(MDC)染色觀察不同濃度白藜蘆醇(0μM，50μM，100μM，150μM)作用HCT-116p5

3、3+/+和HCT-116p53-/-細胞24 h、48h、72h后細胞的酸性自噬泡結(jié)構(gòu)和數(shù)量變化。
　　3.免疫熒光檢測不同濃度白藜蘆醇(0μM，50μM，100μM，150μM)作用HCT-116p53+/+細胞24h、48h后自噬標志蛋白LC3的表達和分布。
　　44，6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色觀察100μM的白藜蘆醇作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞0h、24 h、48 h、7

4、2 h后細胞核變化及凋亡現(xiàn)象。
　　5.Western Blot方法檢測不同濃度的白藜蘆醇(0μM，50μM，100μM，150μM)作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞24h、48h、72h及同一濃度(100μM)的白藜蘆醇作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞0h、24h、48h、72h后自噬相關(guān)蛋白Beclin1、LC3和凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、C-Beclin1的表

5、達量，分析p53對細胞自噬、凋亡的影響。
　　6.用p53激動劑Nutlin-3與白藜蘆醇共同處理HCT-116p53+/+細胞24h，Western Blot檢測Beclin1、LC3的表達，進一步證實p53與自噬的關(guān)系。
　　7.Caspase-3試劑盒檢測不同濃度的白藜蘆醇(0μM，50μM，100μM，150μM)作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞48h、72h及同一濃度(100μM)的白

6、藜蘆醇作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞0h、24h、48h、72h后Caspase-3酶活性，進一步證實p53與凋亡的關(guān)系。
　　8白藜蘆醇0μM、100μM分別作用HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞24h，以兔(R) IgG和鼠(M) IgG作為陽性對照，Beclin1為沉淀抗體，檢測Beclin1與Bcl-2是否相關(guān)。
　　9.實驗數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析

7、處理，實驗組和對照組比較采用單因素方差分析和t檢驗，結(jié)果以x±SD表示，均以P＜0.05為差異具有顯著性統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果:
　　1.白藜蘆醇對HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞生存率的影響MTT結(jié)果顯示，白藜蘆醇對HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞均有抑制作用，且對HCT-116p53-/-細胞的抑制更明顯。
　　2.白藜蘆醇對HCT-116p53+/+和HCT-1

8、16p53-/-細胞自噬的影響
　　MDC染色結(jié)果顯示，在白藜蘆醇的影響下，HCT-116p53+/+細胞MDC染色陽性細胞自噬泡逐漸增多且增強，自噬明顯;HCT-116p53-/-細胞MDC染色陽性細胞自噬泡有逐漸減少且減弱的趨勢，自噬現(xiàn)象不明顯。
　　免疫熒光結(jié)果顯示LC3主要定位在HCT-116p53+/+細胞的細胞漿中，LC3熒光強度隨著白藜蘆醇的濃度增加而升高。
　　Western Blot檢測自噬相關(guān)蛋白，

9、結(jié)果顯示HCT-116p53+/+細胞中，Beclin1、LC3Ⅱ的表達均隨著白藜蘆醇濃度的增加而逐漸增強;Beclin1隨白藜蘆醇作用時間延長而逐漸增強，LC3Ⅱ在0-48h時隨時間的延長表達逐漸增強，在48-72h時隨時間的延長LC3Ⅱ的表達減弱。而在HCT-116p53-/-細胞中，Beclin1的表達隨白藜蘆醇濃度的增加而逐漸降低，隨白藜蘆醇作用時間的延長而逐漸降低。
　　3.p53激動劑Nutlin-3作用下，p53對白

10、藜蘆醇誘導細胞自噬的影響
　　Western Blot結(jié)果顯示，HCT-116p53+/+細胞經(jīng)Nutlin-3處理后，Beclin1、LC3Ⅱ表達均隨p53的增加而增多，MDM2對應表達增多。在Nutlin-3與白藜蘆醇共同處理的三者中比較，隨p53表達增多，MDM2表達降低;在白藜蘆醇處理的三者中比較，隨p53表達增多，MDM2表達降低。
　　4.白藜蘆醇對HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞凋亡的

11、影響
　　DAPI染色結(jié)果顯示，隨著白藜蘆醇作用時間的延長，HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞均發(fā)生了凋亡，但HCT-116p53-/-細胞發(fā)生凋亡的細胞數(shù)量和凋亡程度明顯大于HCT-116p53+/+細胞。
　　Caspase-3酶活性結(jié)果顯示，HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞的Caspase-3酶活性均隨著白藜蘆醇濃度的升高、作用時間的延長而增強，但HCT-116p53-

12、/-細胞Caspase-3酶活性明顯強于HCT-116p53+/+細胞。
　　Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白，結(jié)果顯示，在HCT-116p53+/+細胞中，Bax、Bcl-2的表達均隨著白藜蘆醇濃度的增加和作用時間的延長而逐漸增強。在HCT-116p53-/-細胞中，N-Beclin1的表達隨著白藜蘆醇作用時間的延長而逐漸降低，C-Beclin1的表達隨著白藜蘆醇作用時間的延長而逐漸增強。
　　5.Beclin1與

13、Bcl-2的相互作用對白藜蘆醇誘導HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞自噬的影響
　　免疫沉淀結(jié)果顯示，HCT-116p53+/+和HCT-116p53-/-細胞中的Beclin1與Bcl-2相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　1.白藜蘆醇能誘導HCT-116 p53+/+和HCT-116p53-/-細胞自噬與凋亡共存。對于HCT-116p53+/+細胞，白藜蘆醇主要通過自噬性細胞死亡的方式抑制其生長;在HC