貝母素乙對人結(jié)腸癌HCT-116細胞基因表達譜的影響及其自噬的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　結(jié)腸癌(colon cancer)是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，我國結(jié)腸癌的發(fā)病率逐年上升。結(jié)腸癌的治療一般以手術(shù)治療為主，并配合化學(xué)治療以及靶向治療，但患者尤其是晚期結(jié)腸癌患者的生存及預(yù)后不甚理想。中醫(yī)藥在結(jié)腸癌的治療中具有一定療效，可以通過降低結(jié)腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移機率，改善患者的生存質(zhì)量，但臨床治療效果個體差異較大，作用機制仍有待進一步明確。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，中藥提取物貝母素乙（peiminine）在體外實驗

2、中能夠明顯抑制人結(jié)腸癌HCT-116細胞生長，因此，本研究擬繼續(xù)研究貝母素乙對人結(jié)腸癌HCT-116細胞基因表達譜的影響，并觀察貝母素乙對人結(jié)腸癌HCT-116細胞自噬的作用，明確該單體對人結(jié)腸癌HCT-116細胞的分子作用靶點和作用機制，為該藥物的開發(fā)及臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　研究方法：
　　1.采用Affymetrix公司的PrimeView?Human Gene Expression Array基因表達譜芯片探究中

3、藥提取物貝母素乙對人結(jié)腸癌HCT-116細胞基因表達譜的影響。將實驗分為貝母素乙組和對照組，分別干預(yù)人結(jié)腸癌 HCT-116細胞后，提取總RNA，隨后基因芯片雜交步驟按照北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司提供的基因表達譜芯片實驗操作流程進行，并進行數(shù)據(jù)處理和分析。
　　2.將穩(wěn)定表達GFP-LC3的質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染至人結(jié)腸癌HCT-116細胞，用不同濃度（0uM、50uM、100uM、200uM）的貝母素乙作用該細胞，對照組用相同體積的DM

4、SO處理，使用共聚焦顯微鏡觀察自噬現(xiàn)象；將不同處理的貝母素乙作用HCT-116細胞，即5個給藥濃度（0 uM，50uM，100uM，200 uM，400uM）和五個給藥時長(0小時，4小時，8小時，12小時，24小時)，蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測自噬相關(guān)蛋白的表達。
　　研究結(jié)果：
　　1.篩選出37個差異基因，貝母素乙組和對照組比較，顯著上調(diào)5個，下調(diào)32個。經(jīng)過GO（Go Ontology）富

5、集分析，差異基因主要集中在生物學(xué)過程和分子功能方面，而在細胞組分方面無明顯差異；在生物學(xué)過程中差異基因主要集中在熱生成調(diào)控、運動行為調(diào)控、尿嘧啶核苷代謝過程、腎上腺素能受體信號通路的調(diào)控、脂肪組織代謝的調(diào)控和 G蛋白偶聯(lián)受體信號通路的調(diào)控；在分子功能方面表現(xiàn)為腎上腺素能受體結(jié)合活性和尿嘧啶核苷磷酸化酶活性。經(jīng)過KEGG富集分析，差異表達基因主要集中在藥物代謝酶、嘧啶代謝、酮體合成和降解、維生素B6代謝、核糖體方面。
　　2.在共聚

6、焦顯微鏡下，可以明顯觀察到貝母素乙組中多個明亮的綠色熒光斑點聚集成團塊狀，形成自噬斑，而對照組呈散點狀分布，且隨著貝母素乙濃度的升高，自噬細胞數(shù)量逐漸增多。蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測，與對照組相比，200 uM和400uM的貝母素乙以及200 uM的貝母素乙處理細胞不同時長(4小時，8小時，12小時，24小時)，LC3B-II/LC3B-I比值及SQSTM1（p62）均成顯著升高的趨勢（P＜0.05）。

7、>　　結(jié)論：
　　從基因?qū)用娴慕Y(jié)果提示差異表達基因有37個，這些基因的變化均可能是貝母素乙抗腫瘤作用的靶點，主要體現(xiàn)在對細胞增殖、氟尿嘧啶代謝通路的影響、能量代謝、對YY1轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控四個方面。其中YY1基因的上調(diào)，共聚焦顯微鏡觀察到自噬斑，蛋白免疫印跡法檢測到自噬蛋白LC3B-II、SQSTM1（p62）的表達，均提示貝母素乙對人結(jié)腸癌 HCT-116細胞的作用與自噬相關(guān)，有利于貝母素乙藥理活性的深入研究，為浙貝母抗腫瘤的臨床