RNA干擾Slug基因?qū)Y(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為影響及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分、Slug和E-cadherin在結(jié)直腸組織中表達(dá)及臨床意義
　　目的:探討Slug和E-cadherin在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及預(yù)后意義及二者可能存在的相關(guān)性。
　　方法:應(yīng)用免疫組化SP法檢測65例結(jié)直腸癌組織，25例癌旁正常結(jié)直腸組織中Slug和E-cadherin的表達(dá)，分析兩者表達(dá)水平與臨床病理特征及患者預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:Slug在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)率為47.1％，而在正常結(jié)直腸組織中表達(dá)率

2、為12％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01);E-cadherin在結(jié)直腸癌組織中異常表達(dá)率為55.4％，而在正常結(jié)直腸組織中表達(dá)率為8％，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p＜0.01）;兩者陽性表達(dá)率與腫瘤浸潤深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分期相關(guān)性均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。相關(guān)性分析顯示Slug和E-cadherin無相關(guān)性。
　　結(jié)論:Slug和E-cadherin的表達(dá)異?？赡芘c結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移相關(guān)并可作為評(píng)價(jià)結(jié)直腸癌生物學(xué)行

3、為和預(yù)后的重要指標(biāo)。
　　第二部分、Slug基因RNAi慢病毒載體的制備、包裝與病毒滴度測定
　　目的:構(gòu)建Slug基因RNA干擾(RNA interference，RNAi)慢病毒表達(dá)載體。
　　方祛:篩選出能有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中的Slug基因表達(dá)的siRNA序列:設(shè)計(jì)出4個(gè)針對靶基因Slug序列的siRNA序列，構(gòu)建重組shRNA質(zhì)粒，并小量包裝shRNA慢病毒表達(dá)載體，同時(shí)轉(zhuǎn)染入結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116中，采用熒光

4、定量PCR與WB法分別測定轉(zhuǎn)染后HCT116細(xì)胞中Slug mRNA和蛋白的表達(dá)水平，驗(yàn)證沉默效果，篩選出有效的靶點(diǎn)。構(gòu)建pGC-Slug-GFP，將篩選出來的siRNA序列構(gòu)建成重組shRNA質(zhì)粒，并大量包裝，同時(shí)檢測病毒的滴度。
　　結(jié)果:成功構(gòu)建慢病毒表達(dá)載體pGC-Slug-GFP，三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后可見大量綠色熒光;濃縮病毒后測定其滴度為2×107 TU/ml;以復(fù)感染系數(shù)MOI為1感染293T細(xì)胞，感染效率在9

5、0％以上。RT-PCR與Western blot證實(shí)Slug RNAi慢病毒載體能夠抑制Slug的表達(dá)。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建Slug慢病毒表達(dá)載體，包裝得到高滴度慢病毒，為后續(xù)感染結(jié)腸癌細(xì)胞，探索其在結(jié)直腸癌發(fā)生和發(fā)展中的作用奠定了基礎(chǔ)。
　　第三部分、慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾沉默Slug基因?qū)Y(jié)腸癌HCT116細(xì)胞生物學(xué)行為的影響
　　目的:探討利用RNA干擾(RNA interference，RNAi)技術(shù)研究沉默S

6、lug基因，對結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞增殖和周期的影響。
　　方法:構(gòu)建Slug基因特異性siRNA慢病毒載體，感染結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，設(shè)立未轉(zhuǎn)染組、陰性對照組及轉(zhuǎn)染組三組，MTT法和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測Slug基因在siRNA作用下的細(xì)胞增殖率，劃痕愈合實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡周期變化情況，Transwell法檢測各組細(xì)胞侵襲能力的變化。
　　結(jié)果:轉(zhuǎn)染Slug siRNA后，MTT和克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測，干擾