力達(dá)霉素對(duì)不同p53基因型人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用機(jī)制.pdf

1、本論文系統(tǒng)的探討了LDM對(duì)表達(dá)不同p53基因的人結(jié)腸癌細(xì)胞中的作用中，以及LDM對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞作用的劑量依賴性、p53依賴性和非依賴性。 1.LDM對(duì)不同p53基因型人結(jié)腸癌細(xì)胞作用的劑量依賴性和p53依賴性。結(jié)腸癌細(xì)胞在所有的人腫瘤細(xì)胞基因表達(dá)中具有很高的突變性和復(fù)雜性。P53在許多主要組織來(lái)源的腫瘤中均發(fā)生了不同程度的突變，其中腸癌的突變率大約是60％<'(1)>。為了評(píng)價(jià)不同p53基因型人結(jié)腸癌細(xì)胞對(duì)LDM反應(yīng)的特點(diǎn)，將表

2、達(dá)不同p53基因型的人結(jié)腸癌細(xì)胞(包括p53野生型、p53突變型和p53敲除型)作為研究對(duì)象，考察了LDM對(duì)其作用特點(diǎn)。用MTT法檢測(cè)LDM對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞作用24h的生長(zhǎng)抑制作用、用流式細(xì)胞儀分析凋亡相關(guān)的亞G1峰比例。MTT結(jié)果表明：LDM對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)顯著的劑量相關(guān)的p53依賴性：在10 nM水平，LDM對(duì)p53野生型的結(jié)腸癌細(xì)胞(包括：HCT116，LOVO，COLO205)的生長(zhǎng)抑制作用(范圍在50-70％之間

3、)比p53突變型結(jié)腸癌細(xì)胞(包括HCT15，HT29，SW620和SW480)更高(大約在10-25％之間)；然而，當(dāng)細(xì)胞用1μM劑量的LDM處理后，則失去了這種p53依賴性，即兩類表達(dá)不同p53基因的細(xì)胞死亡的比例接近(>60％)。流式細(xì)胞儀分析LDM作用于結(jié)腸癌細(xì)胞的亞G1峰比例，結(jié)果趨勢(shì)與MTT相似。 2.LDM對(duì)HCT116細(xì)胞作用的p53依賴性和非依賴性。為了深入探討p53在LDM對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞的作用中所發(fā)揮的作用，采

4、用一對(duì)表達(dá)不同p53基因型的人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞作為主要研究對(duì)象，其中母本細(xì)胞是HCT116 p53 wt(p53野生型)細(xì)胞，表達(dá)野生型p53基因，另一種細(xì)胞是用同源重組的方法將p53基因從HCT116母本細(xì)胞中敲除后的HCT116 p53 ko細(xì)胞(p53敲除型)<'(2)>。HCT116細(xì)胞是一種錯(cuò)配缺失的腫瘤細(xì)胞，基因表達(dá)穩(wěn)定且很少分化<'(3)>，其p53基因是野生型的，對(duì)外界刺激比較敏感。LDM作用于HCT116 p53

5、wt和p53 k0細(xì)胞24h后，分別用MTT和流式細(xì)胞儀檢測(cè)LDM的生長(zhǎng)抑制作用和亞G1峰比例。結(jié)果表明，在10 nM水平，LDM。的生長(zhǎng)抑制作用呈現(xiàn)顯著p53依賴性和時(shí)間依賴性，即LDM對(duì)p53野生型HCT116細(xì)胞對(duì)的生長(zhǎng)抑制作用比p53敲除型細(xì)胞明顯(具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p<0.05)，而在100-1000 nM水平，兩種細(xì)胞經(jīng)LDM處理后早在6h即出現(xiàn)顯著的生長(zhǎng)抑制，且比例接近，這說(shuō)明在HCT116細(xì)胞中，高劑量的LDM對(duì)HCT11

6、6細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用不依賴p53，該結(jié)果與FACS的結(jié)果一致。Western blot檢測(cè)p53和p21蛋白表達(dá)情況，10 nM LDM能時(shí)間依賴的誘導(dǎo)野生型細(xì)胞中p53活性增加，且對(duì)p53的誘導(dǎo)作用發(fā)生在早期(給藥后0.5h即能檢測(cè)到)，相比之下，對(duì)照藥MMC 30μM作用后12h才檢測(cè)到對(duì)p53的誘導(dǎo)作用。P21作為p53功能性升調(diào)節(jié)的下游蛋白表達(dá)也隨之增加。P53敲除型細(xì)胞中雖然不表達(dá)p53，但在10 nM LDM作用下有大約15

7、％的細(xì)胞凋亡，這說(shuō)明低劑量LDM作用通過(guò)p53非依賴的方式誘導(dǎo)凋亡。相比之下，高劑量LDM(1μM)對(duì)HCT116細(xì)胞中p53和p21的蛋白表達(dá)沒(méi)有影響，這說(shuō)明高劑量LDM的作用不通過(guò)p53依賴通路介導(dǎo)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡相關(guān)的亞G1峰比例，5-Fu在375μM濃度時(shí)對(duì)HCT116細(xì)胞的作用與LDM相似，也具有p53依賴性，p53野生型：HCT116細(xì)胞對(duì)5-Fu更敏感。MTT法檢測(cè)LDM和幾種常見(jiàn)抗腫瘤藥物的IC50值，包括5-氟尿嘧

8、啶(5-Fu)、絲裂霉素C(MMC)、紫杉醇和阿霉素等。結(jié)果表明LDM的IC50值比其它幾種藥物至少低3個(gè)數(shù)量級(jí)。LDM、5-Fu和MMC對(duì)p53野生型細(xì)胞的IC50值低于p53敲除型細(xì)胞，紫杉醇對(duì)兩種細(xì)胞的IC50值沒(méi)有顯著差別，而p53敲除型細(xì)胞相對(duì)于野生型細(xì)胞對(duì)阿霉素更敏感，這說(shuō)明紫杉醇和阿霉素可能存在其它獨(dú)特的不依賴于p53活性的作用機(jī)制。 以前的研究表明，LDM的作用原理與對(duì)染色質(zhì)DNA的切割有關(guān)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證LDM

9、的作用方式，用DNA特異性熒光染料Hoechst 33342對(duì)LDM作用后的HCT116細(xì)胞核染色，在熒光顯微鏡下觀察并記錄染色質(zhì)的凝集特點(diǎn)。10 nMLDM處理HCT116細(xì)胞24h，觀察到大部分細(xì)胞為典型的凋亡式染色質(zhì)凝集，細(xì)胞核固縮呈塊狀，細(xì)胞形態(tài)變小，出現(xiàn)凋亡小體等，p53 wt細(xì)胞凋亡小體的數(shù)目顯著多于p53 ko細(xì)胞，絲裂霉素(MMC)作為陽(yáng)性對(duì)照藥，在30μM濃度時(shí)，也能誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞出現(xiàn)依賴于p53的典型凋亡特征；

10、與之凋亡形成鮮明對(duì)照的是，1 μM LDM處理后的：HCT116細(xì)胞出現(xiàn)一種異型的染色質(zhì)凝集方式，該染色質(zhì)凝集的特征為：核膜一直保持完整，染色質(zhì)既沿核膜邊緣凝集，又在細(xì)胞核中間凝集，呈散點(diǎn)狀分布，細(xì)胞仍貼壁，不漂浮到培養(yǎng)基中；死亡后期不形成凋亡小體，最后細(xì)胞崩解；染色質(zhì)凝集出現(xiàn)的時(shí)間較短(大約2小時(shí))，不像細(xì)胞凋亡那樣需一個(gè)較長(zhǎng)的時(shí)間(>12h)，這種特別的染色質(zhì)凝集方式與。p53的表達(dá)與否無(wú)關(guān)。這說(shuō)明高劑量LDM可能通過(guò)快速直接切割染

11、色質(zhì)。DNA而發(fā)揮其高效抗腫瘤作用。TUNEL染色法觀察LDM作用后HCT116兩種細(xì)胞死亡的狀態(tài)，與染色質(zhì)凝集的結(jié)果一致。瓊脂糖凝膠電泳對(duì)LDM作用后的HCT116細(xì)胞基因組。DNA進(jìn)行電泳，在10 nM水平，LDM對(duì)DNA的切割具有p53依賴性，p53 wt細(xì)胞中出現(xiàn)DNA梯帶的時(shí)間(4h)早于p53 ko細(xì)胞(12h)，而在高劑量時(shí)(1 μM)，LDM處理15分鐘時(shí)即可觀察到明顯的DNA梯帶出現(xiàn)，LDM作用1h后出現(xiàn)大量的DNA梯

12、帶，在兩種細(xì)胞中這種強(qiáng)烈的DNA斷裂作用沒(méi)有區(qū)別，這表明1 μM LDM對(duì)DNA的切割是非p53依賴性的，這也與染色質(zhì)凝集和TUNEL的結(jié)果相吻合。 3．低劑量LDM誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡主要通過(guò)線粒體途徑。線粒體通路與細(xì)胞凋亡和DN_A的損傷反應(yīng)密切相關(guān)<'(4)>，是p53介導(dǎo)凋亡發(fā)生的主要途徑<'(5-7)>。我們用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了線粒體通路的主要指標(biāo)線粒體膜電位(△Ψm)的變化<'(8)>，結(jié)果表明：10 nM LDM

13、作用后△Ψm降低時(shí)間早于DNA斷裂時(shí)間，p53 wt細(xì)胞的△Ψm下降程度比p53 ko型細(xì)胞更顯著，表明10 nM LDM對(duì)△Ψm的作用具有p53依賴的特點(diǎn)；而1μM LDM對(duì)線粒體膜電位沒(méi)有顯著影響，因此推測(cè)高劑量的LDM的作用可能不通過(guò)線粒體途徑。線粒體通路的另一個(gè)重要的檢測(cè)指標(biāo)是活性氧(ROS)的水平，ROS在p53誘導(dǎo)凋亡過(guò)程中的激活通常發(fā)生在△Ψm的上游<'(9)>。在p53 wt細(xì)胞中，觀察到10 nM LDM處理后ROS的

14、顯著升高，p53 ko細(xì)胞的ROS也有少許升高；caspase-9在線粒體凋亡途徑中是一個(gè)關(guān)鍵性蛋白，通過(guò)與細(xì)胞色素c和Apaf-1形成凋亡復(fù)合物而發(fā)揮誘發(fā)凋亡的作用<'(4)>，在p53 wt細(xì)胞中，檢測(cè)到caspase-9表達(dá)水平升高，還檢測(cè)到具有執(zhí)行凋亡功能的caspase-3，6和7以及PARP的激活，PARP從116kDa的大片斷被切割成具有生物活性的89kD亞基，進(jìn)而誘發(fā)凋亡。在p53 ko細(xì)胞中以上線粒體通路相關(guān)的casp

15、ase家族蛋白和PARP也都被激活，但激活的程度不如p53 wt細(xì)胞，這證明p53在線粒體途徑中起誘導(dǎo)作用。在1 μM LDM作用下，HCT116細(xì)胞中的caspase未被激活，有趣的是PARP被切割，與p53的狀態(tài)無(wú)關(guān)，但不是被切割成具有生物活性的89KD大片斷，這說(shuō)明1μM LDM的作用不是通過(guò)典型的線粒體途徑發(fā)揮作用，可能存在其它獨(dú)特的作用機(jī)制。 4.Bcl-2家族在LDM誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中的作用。Bcl-2家族的促凋亡蛋白

16、PUMA、Bax、P-Bad、Bak、Bim在HCT116 p53 wt細(xì)胞經(jīng)10 nM LDM作用后的表達(dá)水平時(shí)間依賴的升高，這表明LDM激活了Bcl-2家族中的促凋亡蛋白；而在p53 ko細(xì)胞中，只有PUMA的表達(dá)水平出現(xiàn)少量增加，抗凋亡蛋白Bcl-2在兩種細(xì)胞中的表達(dá)沒(méi)有顯著變化，說(shuō)明p53在凋亡中發(fā)揮主導(dǎo)性作用，而抗凋亡蛋白Bcl-2在凋亡過(guò)程中的作用并非主導(dǎo)性的；對(duì)于1μM劑量LDM的作用，這些與典型凋亡的線粒體途徑相關(guān)的蛋白

17、表達(dá)在兩種細(xì)胞中都沒(méi)有出現(xiàn)顯著的變化，這說(shuō)明高劑量LDM作用不激活Bcl-2家族。 分別用MTT法和FACS法檢測(cè)了LDM對(duì)p53基因敲除(p53-/-)、PUMA基因敲除(PUMA-/-)和Bax基因敲除(Bax-/-)后的HCT116細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn)同樣在10 nM水平，PUMA-/-和Bax-/-型HCT116細(xì)胞與p53-/-細(xì)胞具有相似的抗凋亡作用，提示LDM誘導(dǎo)凋亡可能與這兩個(gè)基因有關(guān)。而在更高濃度LDM(100-1