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文檔簡介
1、目的
在全球,肺癌是造成癌癥相關(guān)疾病死亡的主要原因。目前鉑類為基礎(chǔ)的兩藥化療方案成為晚期NSCLC的一線治療方案。順鉑(DDP)、卡鉑(CBP)的毒副作用和繼發(fā)性耐藥限制了其臨床應(yīng)用。洛鉑(LBP)為新型的三代鉑類抗癌藥物,在各種腫瘤中展示了良好的抗癌活性。我們擬探討LBP誘導(dǎo)p53野生型的NSCLC細(xì)胞株A549細(xì)胞凋亡的機制。
方法
采用CCK-8法檢測LBP對SK-MES-1(p53突變型),NCI-
2、H1299(p53缺失型)和A549(p53野生型)細(xì)胞的增殖抑制作用;采用shRNA技術(shù)沉默A549細(xì)胞的p53基因;DCFDA染色結(jié)合熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀(FCM)檢測洛鉑作用于A549、A549/NS-shRNA和A549/p53-shRNA細(xì)胞內(nèi)ROS的變化;AnnexinⅤ-PI染色后采用FCM檢測LBP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞、A549/NS-shRNA和A549/p53-shRNA細(xì)胞凋亡;FCM檢測低濃度的LBP對A549細(xì)
3、胞周期的影響;Western Blot法檢測p53、Bax、Bcl-2、clv-PARP、clv-caspase3、caspase8、caspase9和p-p38MAPK等蛋白水平的變化;應(yīng)用抗氧化劑NAC和p38MAPK抑制劑SB203580檢測對LBP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞內(nèi)p53、ROS及p-p38MAPK蛋白的表達(dá)的影響;建立裸小鼠荷瘤模型,用于評價LBP對A549荷瘤鼠荷瘤的抗腫瘤作用;TUNEL法檢測荷瘤組織細(xì)胞的凋
4、亡。
結(jié)果
1.LBP對p53突變型SK-MES-1細(xì)胞的24h,48h和72h的IC50值分別為63.47±1.03μM,15.77±1.09μM和12.0±1.08μM。LBP對p53缺失型H1299細(xì)胞的24h,48h和72h的IC50值分別為67.26±1.06μM,17.98±1.05μM和7.85±1.01μM。LBP對p53野生型A549細(xì)胞的24h,48h和72h的IC50值分別為11.69±1.05
5、μM,5.02±1.11μM和2.43±1.01μM;6μM,12μM的LBP作用于A549細(xì)胞24h后,G1期細(xì)胞的比例分別為72.03%±1.53%和73.78%±1.26%,而對照組G1期只占47.47%±1.59%,LBP能誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生G1期細(xì)胞周期阻滯;當(dāng)12μM和24μM的LBP作用于A54924h后,凋亡細(xì)胞的比率分別為20.2%±1.3%和44.5%±1.6%;當(dāng)上述濃度的LBP作用于A54948h后,凋亡細(xì)胞的
6、比率分別為55.3%±1.2%和70.0%±0.9%;12μM和24μM的LBP作用于A54924h后,隨著濃度的升高同樣視野范圍內(nèi)可見細(xì)胞核的數(shù)量逐漸減少;在12μM的LBP作用24h時,可見部分細(xì)胞核固縮,變形。在24μM的LBP作用于24h時,可見凋亡小體;24μM的LBP作用于A549細(xì)胞4h后,細(xì)胞內(nèi)ROS明顯升高;LBP可誘導(dǎo)A549細(xì)胞PARP、Bax、Clv-caspase3,8,9上調(diào)和Bcl-2的表達(dá)下調(diào),呈濃度依賴
7、性;LBP能抑制A549荷瘤鼠荷瘤的生長和促進(jìn)腫瘤組織細(xì)胞凋亡。
2.LBP對A549/p53-shRNA細(xì)胞的24h、48h和72h的IC50值分別為39.54±1.02μM,27.89±1.13μM和10.93±1.08μM,LBP可抑制A549/p53-shRNA和A549/NS-shRNA細(xì)胞的增殖,且呈時間、濃度依賴性;LBP對A549/NS-shRNA細(xì)胞的24h、48h和72h的IC50值分別為11.48±1.1
8、2μM,5.14±0.94μM和2.49±0.90μM。當(dāng)24μM的LBP作用于A549/NS-shRNA24h后,凋亡細(xì)胞的比率為45.0%±1.1%;當(dāng)上述濃度的LBP作用于A549/p53-shRNA24h后,細(xì)胞未見明顯凋亡,可見A549/NS-shRNA對LBP誘導(dǎo)的凋亡更敏感;LBP可誘導(dǎo)A549/NS-shRNA細(xì)胞內(nèi)ROS的上調(diào),而相同濃度的LBP作用于A549/p53-shRNA細(xì)胞,細(xì)胞內(nèi)ROS輕度上調(diào);LBP能誘導(dǎo)
9、A549/NS-shRNA的p53和p-p38MAPK的上調(diào);A549/p53-shRNA的基礎(chǔ)p-p38MAPK上調(diào),LBP未能誘導(dǎo)其表達(dá)上調(diào)。NAC及SB203580能阻斷LBP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的促凋亡作用。NAC能阻斷LBP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的ROS上調(diào)但SB203580未能阻斷LBP誘導(dǎo)的ROS上調(diào)。NAC及SB203580不能阻斷LBP誘導(dǎo)的A549細(xì)胞的p53的上調(diào)。
結(jié)論
1.LBP對p53野生型的A
10、549更加敏感。低濃度LBP能誘導(dǎo)A549細(xì)胞發(fā)生G1期細(xì)胞阻滯。LBP能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡;LBP能誘導(dǎo)RARP、Bax、elv-caspase3、clv-caspase8、clv-caspase9的表達(dá)上調(diào)和Bcl-2表達(dá)下調(diào),表明內(nèi)、外源性凋亡通路都參與了LBP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。
2.LBP可通過誘導(dǎo)腫瘤組織細(xì)胞凋亡來抑制A549荷瘤鼠荷瘤的生長。
3.首次發(fā)現(xiàn)p53/ROS/p38MAPK通路參與了p53野生
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