蟾毒靈通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和化療增敏在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中發(fā)揮抗腫瘤作用.pdf

1、肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中非小細(xì)胞肺癌(non-smallcell lung cancer，NSCLC)占全部肺癌的80％以上，居腫瘤死亡原因之首。NSCLC生物學(xué)特征為易發(fā)生局部浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，多數(shù)患者在診斷時(shí)已處于局部晚期或有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，整體五年生存率僅15％。對(duì)于此部分患者，第三代新藥聯(lián)合鉑類為的化療是一線治療，對(duì)順鉑敏感性下降是療效降低的主要原因，往往導(dǎo)致治療失敗。因此，迫切需要探索新的治療方案。
　　既往的

2、臨床試驗(yàn)研究證實(shí)許多自中草藥具有有效抗腫瘤作用，許多中藥也已經(jīng)用于腫瘤的輔助治療。蟾毒靈作為中草藥蟾酥的提取物之一，相對(duì)分子質(zhì)量為386.5，屬強(qiáng)心甙類物質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，其可以通過調(diào)控不同的分子通路對(duì)多種實(shí)體腫瘤如胰腺癌、胃癌、乳腺癌產(chǎn)生抗瘤作用，也有研究證實(shí)蟾毒靈可抑制肺癌細(xì)胞的增殖，但其機(jī)制尚不明確。此外，另有研究表明蟾毒靈具有化療增敏作用，甚至可以逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性。然而，蟾毒靈對(duì)NSCLC細(xì)胞的抗腫瘤機(jī)制以及化療增敏作用尚不明確

3、。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在研究蟾毒靈對(duì)NSCLC細(xì)胞的作用及潛在分子機(jī)制，探索蟾毒靈對(duì)NSCLC順鉑化療敏感性的影響及可能參與機(jī)制，我們選用A549和H1975這兩株NSCLC細(xì)胞為模型，分三個(gè)部分進(jìn)行研究。
　　第一部分 蟾毒靈對(duì)非小細(xì)胞肺癌A549和H1975細(xì)胞增殖的影響
　　目的:研究蟾毒靈是否抑制NSCLC細(xì)胞增殖能力及遷移能力。
　　方法:利用不同濃度的蟾毒靈分別處理A549和H1975細(xì)胞24h、48h和7

4、2h，采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的改變，采用劃痕實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞遷移能力改變。
　　結(jié)果:A549和H1975細(xì)胞經(jīng)不同濃度（2.5nM，5nM，10nM，20nM，40nM，80nM，100nM，200nM）的蟾毒靈處理后，兩株細(xì)胞均呈現(xiàn)為:經(jīng)低濃度蟾毒靈(2.5nM，5nM)處理后細(xì)胞存活率在98％左右，表明細(xì)胞增殖能力無明顯抑制;細(xì)胞經(jīng)較高濃度(10～200nM)蟾毒靈處理后，細(xì)胞增殖受到明顯抑制且這種抑制作用隨著蟾毒靈濃

5、度的增加，細(xì)胞的增殖抑制率增加，蟾毒靈的作用于細(xì)胞的時(shí)間的越長(zhǎng)，細(xì)胞的增殖抑制越明顯。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞經(jīng)蟾毒靈處理后，細(xì)胞遷移能力下降，劃痕愈合能力降低，且藥物濃度越高，對(duì)細(xì)胞遷移能力抑制越明顯。
　　結(jié)論:蟾毒靈可以誘導(dǎo)A549和H1975細(xì)胞產(chǎn)生與濃度和作用時(shí)間相關(guān)的增殖抑制與遷移能力下降。
　　第二部分 蟾毒靈對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞凋亡的影響及可能的分子機(jī)制
　　目的:研究蟾毒靈對(duì)A549和H1975細(xì)胞凋亡的

6、影響及可能參與機(jī)制。
　　方法:以不同濃度的蟾毒靈（0nM，10nM，20nM）作用于A549和H1975細(xì)胞48h，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞凋亡比率影響;采用Western blotting技術(shù)檢測(cè)A549和H1975細(xì)胞中凋亡蛋白parp及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)蛋白β-catenin及其下游分子c-myc和cyclinD1的表達(dá)，以及干細(xì)胞標(biāo)記Oct-4表達(dá)水平。
　　結(jié)果:對(duì)細(xì)胞凋亡比率的檢測(cè)結(jié)果表

7、明，兩株細(xì)胞均表現(xiàn)為:隨著蟾毒靈濃度的增加，細(xì)胞的凋亡比率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，這個(gè)現(xiàn)象說明蟾毒靈可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且藥物濃度越高，凋亡比率越高。Western blotting顯示，藥物處理后，PARP被降解，而cleaved-PARP表達(dá)水平升高;Wnt/β-catenin信號(hào)通路β-catenin及其下游分子c-myc和cyclinD1表達(dá)均下調(diào)，腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記Oct-4表達(dá)也降低。且藥物濃度越高，蛋白表達(dá)降低越明顯。
　　結(jié)論:蟾

8、毒靈在A549和H1975細(xì)胞中可能是可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路的活化，降低β-catenin及下游分子的表達(dá)以及抑制腫瘤干細(xì)胞亞群比例，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增加。
　　第三部分 蟾毒靈對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的順鉑化療增敏作用及可能分子機(jī)制
　　目的:研究蟾蜍靈是否可增加A549和H1975細(xì)胞的順鉑敏感性及其潛在分子機(jī)制。
　　方法:本文第一部分結(jié)果可知，NSCLC細(xì)胞經(jīng)低濃度蟾毒靈(2.5nM，5nM

9、)處理后存活率在98％左右，低濃度蟾毒靈對(duì)細(xì)胞增殖能力無明顯影響。采用CCK-8法檢測(cè)低濃度蟾毒靈、順鉑單藥及聯(lián)合分別作用于A549和H1975細(xì)胞48h后細(xì)胞增殖活性變化;采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)蟾毒靈、順鉑單藥及聯(lián)合處理A549細(xì)胞（蟾毒靈5nM、順鉑5μg/mL）與H1975細(xì)胞(蟾毒靈5nM、順鉑1μg/mL)48 h后細(xì)胞凋亡比率;采用Western blotting檢測(cè)蟾毒靈、順鉑單藥及聯(lián)合處理后A549和H1975細(xì)胞中NF-κ

10、B及其下游分子c-myc表達(dá)水平的改變。
　　結(jié)果:兩株細(xì)胞經(jīng)上述處理后均表現(xiàn)為:與單獨(dú)應(yīng)用順鉑相比，低濃度蟾毒靈與順鉑聯(lián)合應(yīng)用可明顯增加順鉑對(duì)A549與H1975細(xì)胞的增殖抑制作用。流式檢測(cè)結(jié)果顯示，低濃度蟾毒靈組無明顯細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)作用，而聯(lián)合組細(xì)胞凋亡比率明顯大于順鉑組，說明低濃度蟾毒靈可以增加A549與H1975細(xì)胞對(duì)順鉑的藥物敏感性。低濃度蟾蜍靈與順鉑聯(lián)合組細(xì)胞NF-κB及其下游分子c-myc蛋白表達(dá)水平較順鉑單藥組明顯降