polι對非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞放、化療敏感性的影響.pdf

1、背景及目的：Polι基因編碼區(qū)含有2147bp,整個(gè)基因有5個(gè)保守模序。其編碼產(chǎn)物DNA聚合酶ι(Polι)由715個(gè)氨基酸殘基組成,是目前發(fā)現(xiàn)的保真性最低的Y家族DNA聚合酶,也是參與跨損傷合成的主要DNA聚合酶成員之一。本實(shí)驗(yàn)通過研究Polι基因?qū)Ψ切〖?xì)胞肺癌細(xì)胞H1299的生長、增殖和放化、療敏感性的影響,為Polι基因成為肺癌治療的新基因靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：本研究通過構(gòu)建 Polι基因過表達(dá)載體 pcDNA-Po

2、lι、Polι基因干擾載體shRNA-Polι及空載體shRNA-NC,并設(shè)pcDNA3.1載體組做對照,經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染非小細(xì)胞肺癌 H1299細(xì)胞,(1)用半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和 Western blot方法檢測過表達(dá)、沉默Polι基因?qū)Ψ伟〩1299細(xì)胞Polι基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響;(2)MTT法檢測各組吸光度值,計(jì)算對照組(未轉(zhuǎn)染)和各轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的細(xì)胞存活率;(3)MTT法測定轉(zhuǎn)染shRNA-Polι

3、和shRNA-NC的H1299細(xì)胞經(jīng)不同濃度順鉑作用后的細(xì)胞存活率;(4)用10μg/ml的順鉑處理各組轉(zhuǎn)染后的H1299細(xì)胞24h,采用MTT法檢測Polι對H1299鉑類藥物耐受性的影響;(5)采用不同劑量(0、2、4、6、8和10Gy)的60Coγ射線照射各組轉(zhuǎn)染后的H1299細(xì)胞,通過細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)測定Polι對H1299放射敏感性的影響,并利用―多靶單擊‖數(shù)學(xué)模型((S=1-(1-e-D/D0)N))進(jìn)行曲線擬合,獲得細(xì)胞存

4、活曲線。
　　結(jié)果：(1)RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pcDNA-Polι的細(xì)胞株P(guān)olι基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平較其對照組(pcDNA3.1)增高(P<0.05);轉(zhuǎn)染shRNA-Polι的細(xì)胞株P(guān)olι基因的mRNA和蛋白表達(dá)水平較其對照組(shRNA-NC)降低(P<0.05);(2)MTT法顯示,Polι基因過表達(dá)(pcDNA-Polι)的細(xì)胞株細(xì)胞增殖率高于其對照組(pcDNA3.1)(P<0

5、.05),而Polι基因下調(diào)表達(dá)(shRNA-Polι)的細(xì)胞株細(xì)胞增殖率低于其對照組(P<0.05);(3)隨藥物濃度的增高,較對照組及shRNA-NC轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞,shRNA-Polι轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的相對存活率降低(P<0.05);(4)Polι過表達(dá)的細(xì)胞株相對其對照組(pcDNA3.1載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)對順鉑的耐受性增加(P<0.05),而Polι低表達(dá)的細(xì)胞株相對其對照組(shRNA-NC載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞)對順鉑的敏感性增加(P<0.

6、05);(5)shRNA-Polι轉(zhuǎn)染組與對照組(shRNA-NC轉(zhuǎn)染組)相比,其克隆形成能力明顯受到抑制(P<0.05);pcDNA-Polι轉(zhuǎn)染組與對照組(pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組)相比,其克隆形成能力明顯增強(qiáng)(P<0.05);(6)shRNA-Polι轉(zhuǎn)染組的平均致死量(D0)、Dq、N、SF2值(分別為2.266,0.1533,1.070和0.4352)均較其對照組(shRNA-NC轉(zhuǎn)染組)(分別為3.149,0.3001,1.1

7、0和0.5640)降低(P<0.05),pcDNA-Polι轉(zhuǎn)染組的平均致死量(D0)、Dq、N、SF2值(分別為3.702,2.064,1.746和0.7825)均較其對照組(pcDNA3.1轉(zhuǎn)染組)(分別為2.97,0.4382,1.159和0.5625)增高(P<0.05)。
　　結(jié)論：Polι過表達(dá)可促進(jìn)H1299增殖,增加該細(xì)胞對順鉑和放射線的抵抗性;抑制Polι表達(dá)可減慢H1299增殖,增加該細(xì)胞對順鉑和放射線的敏感性