RNA干擾抑制肺腺癌細(xì)胞HMGA1表達(dá)對(duì)化療敏感性的影響.pdf

1、目的：(1)構(gòu)建和鑒定人HMGAl基因RNA干擾慢病毒表達(dá)載體；(2)探討小干擾RNA沉默HMGAl表達(dá)對(duì)肺腺癌細(xì)胞株SPCA-1藥物敏感性的影響。 方法：第一部分：針對(duì)已經(jīng)篩選確定的HMGAl基因RNA干擾有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成雙鏈DNA,與經(jīng)HpaI和XhoI酶切后的pGCL-GFP載體[含U6啟動(dòng)子和綠色熒光蛋白(GFP)]連接產(chǎn)生LV-shHMGAl慢病毒載體,PCR篩選陽性克隆,測(cè)序鑒定。

2、用LV-shHMGAl慢病毒載體、pHelper1.0和pHelper2.0 3種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293T細(xì)胞,包裝產(chǎn)生慢病毒,以293T。細(xì)胞GFP蛋白的表達(dá)水平測(cè)定病毒滴度。第二部分：將HMGAlsiRNA慢病毒載體轉(zhuǎn)染至SPCA-1細(xì)胞。半定量RT-PCR和Western印跡檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞HMGAl基因表達(dá)的影響,MTT、平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)吉西他濱對(duì)陽性組和陰性組細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖的影響；流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。 結(jié)果：(

3、1)PCR和測(cè)序證實(shí),成功構(gòu)建LV-shHMGAl的慢病毒載體,病毒滴度達(dá)5×107TU/ml。(2)RT-PCR和Western印跡證實(shí)經(jīng)RNA干擾介導(dǎo)的SPCA-1細(xì)胞存在HMGAl基因表達(dá)下調(diào)。分別用不同濃度的吉西他濱處理細(xì)胞72h后,MTT顯示轉(zhuǎn)染HMGAlsiRNA細(xì)胞組較轉(zhuǎn)染陰性siRNA細(xì)胞組細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率明顯增加；在平板上的集落形成率明顯降低；用不同濃度吉西他濱處理細(xì)胞72h后,流式細(xì)胞儀檢測(cè),轉(zhuǎn)染HMGAlsiRNA細(xì)