PGRMC1調(diào)節(jié)乳腺癌細胞化療敏感性的研究.pdf

1、乳腺癌是婦女最常見的惡性腫瘤之一。近年來，乳腺癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢，流行病學(xué)調(diào)查表明，25～35歲乳腺癌發(fā)病大幅增加。10年間平均增長速度高達10.7％。55～65歲為第二個發(fā)病高峰，在一些大中城市已躍居女性惡性腫瘤的首位或第二位，已逐漸成為威脅女性生命健康最常見的疾病之一。乳腺癌的早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和早期治療是提高患者生存率和生存質(zhì)量的關(guān)鍵，因此尋找合適的能夠預(yù)測乳腺癌浸潤轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為的指標，使各類各期乳腺癌盡量得到最恰當?shù)淖瞵F(xiàn)

2、代的治療，提高病人的生存率、治愈率，以及改善患者的生存質(zhì)量，是我們臨床醫(yī)生面臨的重要課題。自20世紀以來，隨著分子生物學(xué)研究的迅速進展，有關(guān)腫瘤發(fā)生的基因?qū)W說已經(jīng)受到普遍重視。新近研究表明，腫瘤的發(fā)生是多基因參與和多階段協(xié)同作用的結(jié)果，導(dǎo)致細胞惡變的癌基因多由突變產(chǎn)生，編碼所產(chǎn)生的變異蛋白使細胞具有惡性特征，促使細胞分化和無限制生長。目前有關(guān)乳腺癌基因及一些相關(guān)因子的研究甚多，是近年來乳腺癌研究的重點和熱點。
　　 研究證實，5

3、0-80％的乳腺癌中發(fā)現(xiàn)了經(jīng)典的雌激素受體ER-α，ER-α陽性與良好的預(yù)后相關(guān)，包括細胞增殖率降低，腫瘤分化的組織學(xué)證據(jù)，以及是否進行抗雌激素內(nèi)分泌治療，但ER-α的狀態(tài)同時也預(yù)示著惡性轉(zhuǎn)移位點。ER-α陽性的腫瘤早已被證實發(fā)生骨，軟骨及生殖系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移的可能性很大，而ER-α陰性的腫瘤則發(fā)生腦肝轉(zhuǎn)移更為普遍。Flototto基于ER-α陽性和陰性的惡性腫瘤的差異蛋白組學(xué)分析意外的發(fā)現(xiàn)在ER-α陰性的這些乳腺癌中出現(xiàn)大量細胞色素b5區(qū)域

4、蛋白PGRMC1高表達且磷酸化的亞群。PGRMC1可能與激素相關(guān)腫瘤的惡性增殖及化療敏感性密切相關(guān)，尤其是作為乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的新的生物指標具有良好前景。本課題研究共分為三章
　　 第一章:PGRMC1在乳腺癌的表達及其生物學(xué)意義
　　 目的:
　　 探討孕激素膜受體1(progesteronereceptormembranecomponent-1，PGRMC1)在乳腺癌中的表達狀況及與臨床病理指標的可能關(guān)系。

5、
　　 方法:
　　 1.采用免疫組織化學(xué)方法回顧性分析檢測60例乳腺癌PGRMC1的表達，并評價其與病理分級、臨床分期、轉(zhuǎn)移，化療敏感性以及預(yù)后之間的關(guān)系。
　　 2.統(tǒng)計學(xué)處理:資料數(shù)據(jù)采用SPSS16.0版統(tǒng)計軟件進行分析。PGRMC1陽性表達和乳腺癌臨床病理學(xué)的計數(shù)資料采用Fisher確切概率法、x2檢驗判斷PGRMC1表達與各臨床病理指標的相互關(guān)系，隨訪材料的患者生存情況用Kaplan-Meier方法進

6、行分析，生存率比較用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 60例乳腺癌組織PGRMC1表達陽性37例，陰性23例。PGRMC1的表達與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.004)、腫瘤大小(P=0.03)和臨床分期(P=0.039)密切相關(guān);與年齡(P=0.196)和腫瘤病理分級(P=0.526)無關(guān)。PGRMC1的表達與乳腺癌患者的總體生存率(Log-rank=10.378;P=0.0001

7、)和無瘤生存率(Log-rank=4.443;P=0.035)有關(guān)。多因素分析結(jié)果提示PGRMC1是乳腺癌獨立的預(yù)后因子(P=0.002)。
　　 結(jié)論:
　　 PGRMC1的表達在乳腺癌中有統(tǒng)計學(xué)意義，其表達隨轉(zhuǎn)移和臨床分期升高而增強，可能是乳腺癌的獨立預(yù)后因素之一。
　　 第二章:PGRMC1參與調(diào)控乳腺癌細胞增殖及化療敏感性的實驗研究
　　 目的:
　　 探討孕激素膜受體1(progeste

8、ronereceptormembranecomponent-1，PGRMC1)是否參與乳腺癌細胞增殖及化療藥物敏感性的調(diào)控。
　　 方法:
　　 1.設(shè)計合成以PGRMC1為靶標的siRNA1、2，用lipofectin2000轉(zhuǎn)染入的乳腺癌高轉(zhuǎn)移細胞株MDA-MB-231(ER-，PR-)和低轉(zhuǎn)移細胞株MCF-7(ER+，PR+)，QRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染siRNAs后PGRMC1基因mRNA水平變化，WB法檢測蛋白表達

9、變化，以siRNA-GFP為陽性對照，未處理組為空白對照。CCK8法檢測轉(zhuǎn)染前后DTX敏感性。應(yīng)用1/2的IC50DTX作用轉(zhuǎn)染組與對照組，流式細胞儀檢測各組細胞周期變化，AnnexinV/PI陽性細胞百分比，對比各組細胞凋亡率、死亡率，雙氫二氯熒光黃染色陽性率判定各組細胞內(nèi)ROS水平。JC-1染色后，免疫熒光顯微鏡下觀察各組細胞線粒體膜電位變化。
　　 2.統(tǒng)計學(xué)處理:計量資料采用均數(shù)±標準差表示，采用SPSS13.1軟件包進

10、行統(tǒng)計學(xué)檢驗。統(tǒng)計方法采用獨立樣本t檢驗，p＜0.05被認為具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 以PGRMC1為靶標設(shè)計的siRNA1、2對該基因mRNA及蛋白表達顯著抑制在70％以上，細胞增殖受抑，對化療藥物敏感性增高，與非轉(zhuǎn)染組相比G2期細胞比例明顯增加，凋亡細胞比率明顯增加，細胞內(nèi)ROS水平也隨之升高，線粒體膜電位下調(diào)。
　　 結(jié)論:
　　 PGRMC1參與了乳腺癌細胞增殖及化療敏感性的調(diào)控。

11、r>　　 第三章:miR-128參與PGRMC1調(diào)控乳腺癌化療敏感性的實驗研究
　　 目的:
　　 前期研究提示經(jīng)干預(yù)細胞PGRMC1表達后，化療引起細胞線粒體凋亡途徑顯著活化，芯片顯示miR-128表達明顯下調(diào)，經(jīng)軟件預(yù)測miR-128靶標，本課題將研究方向聚焦在線粒體凋亡相關(guān)因子Bax。
　　 方法:
　　 細胞miR轉(zhuǎn)染24小時后收取細胞提取miRNA或mRNA，轉(zhuǎn)染48小時內(nèi)收取細胞提取蛋白質(zhì)備

12、用。分別將化學(xué)合成的成熟miR-128的MIMIC與pmiR-REPORT-Bax質(zhì)粒及陰性對照在96孔板中用Lipofectamine進行共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24小時以后，進行雙熒光檢測。然后原位雜交檢測miR-128。
　　 結(jié)果:
　　 本課題通過熒光素酶報告系統(tǒng)證實Bax為miR-128的靶標，調(diào)節(jié)miR-128的水平可顯著影響細胞化療敏感性，抑制Bax表達，可逆轉(zhuǎn)miR-128促凋亡的作用。
　　 結(jié)論: