AGEs促進(jìn)ROS的產(chǎn)生激活P38MAPK-JNK信號通路誘導(dǎo)大鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的實驗研究.pdf

1、目的:內(nèi)皮祖細(xì)胞(Endothelial Progenitor Cells，EPCs)由來源于機(jī)體骨髓、外周血等部位的單個核細(xì)胞分化而來，可分裂增殖成為成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞，因此能夠促進(jìn)血管的新生并具有強(qiáng)大的損傷血管修復(fù)功能。目前，糖尿病血管病變已成為影響人類健康的一個重要威脅，而對糖尿病所致的血管病變發(fā)病機(jī)理的大量研究表明，該過程中EPCs的凋亡起著明顯的作用。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞由自體基因調(diào)控的，自主的、程序性的死亡過程，當(dāng)各種原因?qū)е翬P

2、Cs內(nèi)鈣、磷水平急劇升高，則可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡并形成凋亡小體。晚期糖基化終末產(chǎn)物(Advanced Glycation End products，AGEs)是指機(jī)體內(nèi)的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)以及核酸等游離基于無酶作用條件下，自發(fā)的與各種還原單糖反應(yīng)所生成的穩(wěn)定、不可逆轉(zhuǎn)的共價結(jié)合物，是高糖環(huán)境下誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的主要物質(zhì)，正常的生理狀態(tài)下AGEs幾乎不表達(dá)，而在糖尿病患者中AGEs的表達(dá)明顯增加，從而導(dǎo)致了一系列的病理過程。而這一過程中細(xì)胞體內(nèi)眾多的生物

3、傳導(dǎo)信號通路均參與其中，尤其是絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases) MAPKs即為其中最重要的一組信號通路，有研究報道稱抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)(Oxidative Stress)同時亦可抑制AGEs誘導(dǎo)的EPCs凋亡。因此本實驗主要通過觀察體外AGEs是否通過氧化應(yīng)激激活MAPK信號通路從而誘導(dǎo)大鼠骨髓源性EPCs凋亡及其具體的機(jī)制。
　　方法:采用脫臼SD大鼠頸椎的方法處死SD大鼠，

4、后于75％酒精中浸泡消毒20分鐘。消毒后將SD大鼠置于紫外線照射后的超凈工作臺中，使用解剖器械分離大鼠脛骨及股骨，完成分離后，采用含有1％肝素的無菌PBS液沖洗股、脛骨骨髓腔直至骨髓腔變成無色透明為止，將沖洗液收集，高速離心機(jī)離心后小心收集離心管底部細(xì)胞，采用Ficoll密度梯度離心法培養(yǎng)和分離大鼠骨髓源性單核細(xì)胞，成功分離出單核細(xì)胞后，采用清潔巴氏管吸取細(xì)胞懸液后均勻滴于6孔板之中，初次換液為3天，后換液時間為每隔3-4天，使用倒置顯

5、微鏡定期觀察細(xì)胞形態(tài)變化，并使用激光共聚焦顯微鏡鑒定經(jīng)DiI-acLDL和FITC-UEA-1雙熒光染色的EPCs。采用流式細(xì)胞儀檢測經(jīng)不同濃度的AGEs(50ug/l、100ug/l、200ug/l)以及200ug/l濃度AGEs干預(yù)處理不同時間(6h、12h、24h、48h)后EPCs的凋亡率，后采用Western Blot檢測不同濃度及不同時間對EPCs中凋亡蛋白Bax及凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá)以及JNK和P38MAPK信號通

6、路磷酸化產(chǎn)物的活化情況;使用分子探針(DCFH-DA)檢測200ug/l濃度AGEs干預(yù)處理不同時間(3h、6h、12h、24h)后EPCs中活性氧簇(Reactive OxygenSpecies)ROS的表達(dá)量;NAC(抗氧化劑)預(yù)處理EPCs1h后使用200ug/lAGEs干預(yù)24h后檢測ROS表達(dá)的含量以及Bax蛋白相對表達(dá)量;為進(jìn)一步證明P38MAPK和JNK在EPCs凋亡具體機(jī)制中的作用，分別使用經(jīng)典的JNK抑制劑SP6001

7、25(20um)和P38MAPK的抑制劑SB203580(20um)干預(yù)EPCs1h后，采用Western Blot檢測促凋亡蛋白Bax、凋亡抑制蛋白Bcl-2和JNK、P38MAPK磷酸化產(chǎn)物的活化情況。
　　結(jié)果:將骨髓中的單個核細(xì)胞成功分離后，采用EGM-2完全培養(yǎng)基于專用細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)3天后觀察，見70％以上的EPCs貼壁，并呈圓形，少有呈橢圓形、梭形或紡錘形，孵箱繼續(xù)培養(yǎng)至第7天后，鏡下可見EPCs生長迅速，此時觀察已可

8、見細(xì)胞初步呈集落樣生長，以上細(xì)胞再次培養(yǎng)至14天后，再次鏡下觀察可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞出現(xiàn)典型“鋪路石”樣、漩渦樣生長。后為明確所培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs，取出孵育7天后的EPCs進(jìn)行鑒定，采用DIL-acLDL與FITC-UEA-1“雙吞”實驗，使用共聚焦顯微鏡觀察、鑒定細(xì)胞，經(jīng)DIL-acLDL染色后EPCs表現(xiàn)為紅色熒光，而EPCs結(jié)合了FITC-UEA-1后則表現(xiàn)為黃色熒光，紅黃熒光雙染色細(xì)胞被證明為EPCs。所有細(xì)胞經(jīng)干預(yù)之前均采用不含血清的基

9、礎(chǔ)培養(yǎng)基“饑餓”處理24h。后分別予以不同濃度梯度(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)AGEs-BSA干預(yù)、刺激EPCs24h后，凋亡細(xì)胞比率隨著AGEs濃度的增加而進(jìn)行性升高，凋亡率分別為5.94％、9.83％、24.81％，以及200ug/ml濃度AGEs-BSA分別經(jīng)不同時間點刺激(6h、12h、24h、48h)細(xì)胞凋亡呈時間依耐性增加，但24h時為頂峰，凋亡率分別為15.83％、22.75％、27

10、.86％、23.24％，促凋亡蛋白Bax相對表達(dá)量同樣也呈時間、濃度依耐性增加(24h時達(dá)到頂峰)，而凋亡抑制蛋白Bcl-2相對表達(dá)量則呈時間、濃度依耐性降低。同時Western blot檢測P-P38MAPK、P-JNK、T-P38MAPK、T-JNK蛋白含量的表達(dá)，隨著AGEs-BSA濃度(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)的升高P-P38MAPK、P-JNK的相對表達(dá)量呈濃度相關(guān)性增加（分別為P-P

11、38MAPK,0.28±0.01、0.33±0.01、0.41±0.02, vs Medium組，P＜0.01, n=3; P-JNK1.08±0.02、1.36±0.01、1.75±0.01, vs Medium組，P＜0.01，n=3)。而隨著時間的變化P-P38MAPK在24h內(nèi)呈時間相關(guān)性增加，24h時相對表達(dá)量達(dá)到頂峰后逐漸下降，P-JNK相對表達(dá)量在12h內(nèi)呈時間相關(guān)性增加，12h時達(dá)到頂峰后逐漸下降，無論是時間還是濃度的變

12、化，T-JNK和T-P38MAPK的表達(dá)量均沒有發(fā)生任何變化。經(jīng)過DCFH-DA檢測200ug/l濃度AGEs干預(yù)處理不同時間(3h、6h、12h、24h)后EPCs中ROS的表達(dá)量，可見隨著時間的增加EPCs內(nèi)ROS含量的生成亦呈上升趨勢（DCFH-DA熒光的相對表達(dá)量分別為114.41％、119.49％、131.36％、128.32％vsMedium組，P＜0.01，n=3），于12h時達(dá)到頂峰，后逐漸下降。而在加入抗氧化劑NAC過

13、后，ROS的產(chǎn)生、Bax凋亡促進(jìn)蛋白含量的表達(dá)均明顯下降DCFH-DA相對熒光值明顯減少為98.21％vs133.51％(p＜0.01，n=3)，而WesterBlot檢測Bax蛋白含量的表達(dá)明顯降低(0.86±0.01vs0.24±0.01，P＜0.01，n=3)，同僅采用200ug/mlAGEs-BSA干預(yù)的對照組比較，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。在加入JNK抑制劑(SP600125，20um)后，同濃度為200ug/ml

14、AGEs刺激組相比Bax、P-JNK表達(dá)明顯減少（分別為0.95±0.01vs0.40±0.01, P＜0.01, n=3;1.05±0.01vs0.25±0.01,P＜0.01，n=3)，而Bcl-2的表達(dá)明顯增加(0.19±0.01vs0.59±0.01，P＜0.01，n=3)。在加入p38MAPK的抑制劑SB203580(20uM)預(yù)處理后，同濃度為200ug/ml的AGEs-BSA刺激組相比Bax、P-p38MAPK表達(dá)明顯減少