PI3K-mTOR通路在染矽塵肺泡巨噬細(xì)胞自噬中的作用研究.pdf

1、目的：通過給予PI3K抑制劑LY294002、mTOR抑制劑雷帕霉素（RAPA）、抗氧化劑 N-乙酰半胱氨酸（NAC），觀察大鼠肺泡巨噬細(xì)胞 NR8383的自噬活動變化，探討 PI3K/Akt/mTOR信號通路在染塵 NR8383細(xì)胞自噬活動的調(diào)控作用及抗氧化劑NAC是否通過該通路來影響矽肺的發(fā)生和發(fā)展。
　　方法：常規(guī)培養(yǎng)NR8383細(xì)胞，染塵3h、6h、12h、20h、24h后，分別收集細(xì)胞上清液并采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法

2、（ELISA法）檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長因子-βⅠ（TGF-βⅠ）的分泌水平，確定體外巨噬細(xì)胞染塵模型時間。在確定的染塵時間點給予 LY294002、RAPA和NAC，采用 ELISA法檢測、方差分析或者Kruskal-Wallis H法分析TNF-α、TGF-βⅠ的表達水平；采用蛋白免疫印跡方法測定細(xì)胞內(nèi) Akt和p-mTOR蛋白水平；采用細(xì)胞免疫熒光法和蛋白免疫印跡方法（Western blotting）觀察和測

3、定自噬的發(fā)生情況。方差分析或者Kruskal-Wallis H法分析各組自噬蛋白表達情況。
　　結(jié)果：1NR8383細(xì)胞染塵3h、6h、12h、20h、24h，ELISA法檢測TNF-α、TGF-βⅠ的表達。染塵20h TGF-βⅠ的表達高于6h、12h（P<0.05），24h和20h表達含量沒有差異（P>0.05）。染塵細(xì)胞的上清液中 TNF-α含量在12h的表達高于3h、6h（P<0.05），20h的含量高于3h、6h、12h

4、（P<0.05），24h和20h的含量沒有差異（P>0.05）。2不同干預(yù)對 NR8383細(xì)胞上清液中 TNF-α和TGF-βⅠ表達影響。LY294002+矽塵組 TNF-α和TGF-βⅠ表達含量均高于矽塵組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；RAPA+矽塵組 TNF-α的分泌水平較矽塵組降低（P<0.05），而TGF-βⅠ的分泌水平在 RAPA+矽塵組升高（P<0.05）；NAC+矽塵組NR8383細(xì)胞上清中 TNF-α含量較矽塵組下

5、降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。3激光共聚焦觀察 NR8383細(xì)胞自噬活動。與對照組比較，矽塵組NR8383細(xì)胞LC3蛋白熒光信號增強；LY294002+矽塵組較矽塵組胞內(nèi)熒光信號明顯減弱；RAPA+矽塵組較矽塵組胞內(nèi)熒光信號微弱；NAC+矽塵組較矽塵組胞內(nèi)熒光信號無明顯變化。加入溶酶體抑制劑二磷酸氯喹（chloroquine diphosphate，CDP）阻斷自噬降解后，各組NR8383細(xì)胞內(nèi)自噬信號表達均增強。4蛋白免疫印跡

6、法檢測Akt和p-mTOR蛋白的表達。Akt蛋白在LY294002+矽塵組的表達較空白組和矽塵組減弱。p-mTOR在RAPA+矽塵組的表達較空白度和矽塵組減弱。p-mTOR的表達在 NAC+矽塵組與空白組和矽塵組比較無明顯變化。5蛋白免疫印跡法檢測 NR8383細(xì)胞自噬活動。與對照組比較，矽塵組 NR8383細(xì)胞 LC3蛋白表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；LY294002+矽塵組 LC3蛋白表達低于矽塵組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

7、P<0.05）；與矽塵組比較，RAPA+矽塵組 NR8383細(xì)胞 LC3表達呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與矽塵組比較，NAC+矽塵組NR8383細(xì)胞LC3表達呈降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。
　　結(jié)論：1游離SiO2粉塵誘導(dǎo)大鼠NR8383細(xì)胞自噬增加。2 PI3K/Akt信號通路參與矽塵介導(dǎo)的NR8383細(xì)胞自噬變化活動中。3在染矽塵20h NR8383細(xì)胞的自噬變化活動中 mTOR未參與其調(diào)