BMSCs抑制矽肺大鼠肺泡巨噬細胞自噬活化的體外研究.pdf

1、目的：通過體內(nèi)染塵制備大鼠矽肺模型和體外細胞培養(yǎng)實驗，探討：1.在大鼠矽肺的發(fā)生過程中AM內(nèi)是否存在自噬的激活；2. BMSCs移植對AM自噬的調控影響；3. BMSCs對AM自噬的調控與PI3K-AKT-mTOR-P70S6K信號通路的關系。
　　方法：1.動物分組及模型制備：90只SPF級雄性SD大鼠（體質量180~220g）隨機分為三組：模型對照組（control group）、矽肺模型組（model group）、BMSC

2、s治療組（BMSCs treatment group）；5只SPF級雄性SD大鼠（3～5周齡，體質量100~120g）用于 BMSCs分離及培養(yǎng)。采用非暴露式一次性氣管灌注法制備大鼠矽肺模型，一次性灌注滅菌氯化鈉溶液與 SiO2粉塵混懸液（50mg/ml）1.0ml；模型對照組灌注滅菌氯化鈉溶液1.0ml；BMSCs治療組于造模24h后經(jīng)尾靜脈注入BMSCs混懸液1.0ml，約3×106個細胞。2.檢測指標及方法：①BMSCs的鑒定：流

3、式細胞儀檢測 BMSCs表面標記物 CD29，CD45，CD54，CD106的表達；②一般形態(tài)學觀察：蘇木素-伊紅（HE）染色觀察AM形態(tài)；③免疫細胞化學染色法檢測 LC-3，Beclin-1，mTOR，P70S6K的表達及分布；④免疫印跡法檢測 LC-3，Beclin-1，mTOR，P70S6K的蛋白表達量；⑤透射電鏡觀察自噬體的形成。3.定量測定及統(tǒng)計學分析：免疫細胞化學陽性細胞陽性度強弱用Image-ProPlus6.0數(shù)碼醫(yī)學圖

4、像分析系統(tǒng)半定量分析測定，以積分光密度值（IOD值）來表示。蛋白定量用Image J醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)對PVDF膜上蛋白特異表達條帶進行半定量分析，得出平均光密度值（OD值），最后以目標 OD值比內(nèi)參（β-actin）OD值的比值作為分析對象進行比較。實驗中所得數(shù)據(jù)用 Excel建庫，均用均值±標準差（?x±s）表示，用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行完全隨機設計的單因素方差分析，兩組間比較用qq檢驗，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

5、r>　　結果：1. BMSCs的形態(tài)學觀察結果：BMSCs原代細胞胞體小，基本為均勻梭形或圓形，核居中，偶有寬大扁平的多邊形細胞，細胞折光性強，以分散的克隆聚集方式增殖。10d后原代細胞95％融合，此時進行傳代，細胞傳至第三代，形態(tài)更為均一，呈梭形成纖維細胞樣。2. BMSCs表面標記物表達的鑒定結果：結果顯示細胞CD29、CD106抗體陽性表達率分別為75.04％、75.49％，為陽性表達，CD45、CD54抗體陽性表達率分別為4.0

6、7％、4.85％，為陰性表達。3. AM的形態(tài)學觀察結果：HE染色結果顯示模型對照組 AM圓形或橢圓形，結構清晰，輪廓清楚，形態(tài)均一，未見矽塵吞噬顆粒。與模型對照組相比，矽肺模型組 AM體積增大，圓形、橢圓形或不規(guī)則形，形態(tài)不均一，細胞輪廓不清，部分細胞可看到毛刺樣突起，細胞核位于細胞中央或一側，胞質更加疏松豐富，部分細胞胞質內(nèi)可見吞噬的矽塵顆粒。BMSCs治療組與矽肺模型組相比，AM受損程度有所減輕，細胞形態(tài)不均一。4.免疫細胞化學染

7、色結果：模型對照組 LC-3，Beclin-1僅有微弱表達，呈現(xiàn)淡棕黃色。與模型對照組相比，矽肺模型組在各時間點的陽性表達均增強（P<0.05），并且其表達變化呈現(xiàn)出時間依賴性變化趨勢，隨著時間延長，表達強度逐漸增加，其表達至14d時達高峰（P<0.05），28d時有所降低，但仍高于模型對照組的表達（P<0.05）。與矽肺模型組相比，BMSCs治療組在各時間點的表達均減弱（P<0.05），但表達趨勢未變。模型對照組 mTOR，P70S6

8、K蛋白有一定量表達，呈現(xiàn)棕褐色。與模型對照組相比，矽肺模型組在各時間點的陽性表達均減弱（P<0.05），并且其表達變化呈現(xiàn)出時間依賴性變化趨勢，隨著時間延長，表達強度逐漸降低，其14d時表達至低峰（P<0.05），28d時有所回升，但仍低于模型對照組的表達（P<0.05）。與矽肺模型組相比，BMSCs治療組在各時間點的表達均增強（P<0.05），但表達趨勢未變。5. Western blot檢測結果：在模型對照組 LC-3，Beclin

9、-1蛋白僅有微量基礎表達，且各時間點間表達無明顯變化。矽肺模型組和BMSCs治療組LC-3，Beclin-1動態(tài)表達與免疫細胞化學檢測結果相吻合。在模型對照組 mTOR，P70S6K蛋白有一定量的基礎表達，且各時間點間表達無明顯變化。矽肺模型組和BMSCs治療組 mTOR，P70S6K動態(tài)表達與免疫細胞化學檢測結果相吻合。6.透射電鏡結果：模型對照組 AM胞質內(nèi)細胞器豐富，完整，細胞基質均勻一致，溶酶體豐富，線粒體結構完整，核仁清晰，核