不同粉塵對(duì)大鼠肺泡巨噬細(xì)胞表面受體MARCO表達(dá)影響的體外研究.pdf

1、長(zhǎng)期以來,塵肺病是中國(guó)職業(yè)病中發(fā)病率最高、對(duì)勞動(dòng)者危害最為嚴(yán)重的一類職業(yè)病。最新統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示,2010年塵肺病發(fā)病例數(shù)占職業(yè)病報(bào)告總例數(shù)的87.42％,而且其發(fā)病工齡有明顯縮短的趨勢(shì),塵肺病的發(fā)生嚴(yán)重危害著職業(yè)人群的健康狀況及生活質(zhì)量。多年來研究者一直致力于其發(fā)病機(jī)制的研究。
　　 生產(chǎn)性粉塵進(jìn)入肺部后,肺泡巨噬細(xì)胞作為參與機(jī)體防御的首類效應(yīng)細(xì)胞,在塵肺的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。一直以來大多數(shù)的研究均致力于粉塵作用于巨噬

2、細(xì)胞后引起的一系列變化,然而有關(guān)巨噬細(xì)胞如何識(shí)別并吞噬粉塵顆粒的過程尚不清楚,近年來國(guó)外有研究結(jié)果顯示巨噬細(xì)胞對(duì)矽塵的吞噬并非是簡(jiǎn)單的異物吞噬反應(yīng),而是通過巨噬細(xì)胞表面表達(dá)的模式識(shí)別受體MARCO來介導(dǎo)的,這一發(fā)現(xiàn)為塵肺病的研究提供了新的線索。膠原樣結(jié)構(gòu)巨噬細(xì)胞受體(Macrophage receptor with collagenous structure,MARCO)是巨噬細(xì)胞表面A類清道夫受體的一種。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)MARCO參與肺泡

3、巨噬細(xì)胞對(duì)矽塵的吞噬,而且矽塵作用于肺泡巨噬細(xì)胞后可以導(dǎo)致該受體表達(dá)的增加。
　　 除了矽塵,其它很多粉塵也能引起塵肺病,在中國(guó),煤塵所致的塵肺病要高于矽塵,占據(jù)相當(dāng)大的比例。而氧化鋅粉塵則是一種重要的金屬粉塵,也可對(duì)肺部造成嚴(yán)重?fù)p傷。因此,基于國(guó)外的研究,煤塵和氧化鋅粉塵與肺泡巨噬細(xì)胞的作用方式是否也經(jīng)MARCO受體而被肺泡巨噬細(xì)胞所吞噬引起了我們的興趣。因此,該研究擬通過體外實(shí)驗(yàn),原代培養(yǎng)SD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞,使用游離SiO

4、2粉塵、煤塵以及氧化鋅粉塵作用肺泡巨噬細(xì)胞,檢測(cè)不同粉塵刺激對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞表面受體MARCO表達(dá)的影響,探討肺泡巨噬細(xì)胞吞噬二氧化硅粉塵、煤塵和氧化鋅粉塵的方式。
　　 目的:
　　 檢測(cè)游離SiO2、煤塵以及氧化鋅3種粉塵對(duì)肺泡巨噬細(xì)胞表面MARCO受體表達(dá)的影響,探討巨噬細(xì)胞對(duì)煤塵和氧化鋅粉塵的吞噬作用方式。
　　 方法:
　　 1.對(duì)SD大鼠的肺泡巨噬細(xì)胞進(jìn)行分離純化和原代培養(yǎng)。
　　 2.

5、采用MTT比色法測(cè)定各粉塵對(duì)原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞活性的影響,并確定染毒巨噬細(xì)胞的粉塵濃度。
　　 3.使用Real-time PCR檢測(cè)不同濃度粉塵刺激后肺泡巨噬細(xì)胞表面清道夫受體MARCO的mRNA相對(duì)表達(dá)水平。
　　 4.采用Western blot技術(shù)檢測(cè)不同濃度粉塵刺激后肺泡巨噬細(xì)胞表面清道夫受體MARCO的蛋白表達(dá)水平。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:使用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用Levene方法進(jìn)行方差齊性

6、檢驗(yàn),各組之間采用單因素方差分析,兩兩比較用q檢驗(yàn),統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著性檢驗(yàn)以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.分離得到的SD大鼠肺泡巨噬細(xì)胞的成活率在95%以上,培養(yǎng)2 h后巨噬細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好,純化后巨噬細(xì)胞純度達(dá)95%以上。
　　 2.各粉塵對(duì)原代培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞活性的影響:
　　 (1)游離SiO2粉塵濃度為25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml時(shí),巨噬細(xì)胞活性與對(duì)照組0μg/

7、ml進(jìn)行比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),當(dāng)大于100μg/ml濃度時(shí),細(xì)胞活性明顯受到影響,因此,游離SiO2粉塵對(duì)細(xì)胞的染毒濃度設(shè)定在100μg/ml以內(nèi)(0μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml):
　　 (2)煤塵濃度為50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml時(shí),細(xì)胞活性與對(duì)照組0μg/ml比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),當(dāng)大于400μg/m

8、l濃度時(shí),細(xì)胞活性較對(duì)照組明顯降低。因此,煤塵對(duì)細(xì)胞的染毒濃度設(shè)定在400μg/ml以內(nèi)(0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、400μg/ml);
　　 (3)氧化鋅粉塵濃度為25μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml時(shí),巨噬細(xì)胞活性與對(duì)照組0μg/ml比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),當(dāng)大于200μg/ml濃度時(shí),細(xì)胞活性明顯受到影響。因此,金屬氧化鋅粉塵對(duì)細(xì)胞的染毒

9、濃度設(shè)定在200μg/ml以內(nèi)(0μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、150μg/ml、200μg/ml)。
　　 3.Real-time PCR檢測(cè)各組細(xì)胞MARCO的mRNA表達(dá)結(jié)果:
　　 (1)游離SiO2粉塵各濃度組與對(duì)照組相比,染毒濃度在50μg/ml、75μg/ml和100μg/ml時(shí),MARCO的mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 (2)煤塵各濃度組與

10、對(duì)照組相比,染毒濃度在200μg/ml和400μg/ml時(shí),MARCO的mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05):
　　 (3)氧化鋅粉塵各濃度組與對(duì)照組相比,染毒濃度在100μg/ml、150μg/ml和200μg/ml時(shí),MARCO的mRNA表達(dá)量高于對(duì)照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 4.Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞MARCO的蛋白表達(dá)結(jié)果:
　　 (1)游離

11、SiO2粉塵各濃度組與對(duì)照組相比,作用濃度在75μg/ml和100μg/ml時(shí),MARCO的蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 (2)煤塵各濃度組與對(duì)照組相比,作用濃度在100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml時(shí),MARCO的蛋白表達(dá)量明顯高于對(duì)照組,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);
　　 (3)氧化鋅粉塵各濃度組與對(duì)照組相比,作用濃度在150μg/ml和200μg/