大豆疫霉細(xì)胞自噬基因PsAtg6a和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、正常的細(xì)胞死亡有助于維持生物體生理活動(dòng)的運(yùn)行。生物的細(xì)胞死亡包括細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death，PCD)以及細(xì)胞壞死。而細(xì)胞程序性死亡又包括細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬，其中細(xì)胞自噬是細(xì)胞內(nèi)保守的降解過程，這一過程可以將細(xì)胞內(nèi)損傷的細(xì)胞器或者廢棄的蛋白質(zhì)等降解，生成的物質(zhì)重新被細(xì)胞利用。在外部環(huán)境不利如饑餓條件，或者內(nèi)部壓力如損傷的細(xì)胞器的聚集，或者病原菌的侵入時(shí)，細(xì)胞自噬都能幫助細(xì)胞存活，抵抗壓力。細(xì)胞自噬的發(fā)生包括

2、誘導(dǎo)發(fā)生、自噬體的形成、自噬體與溶酶體融合以及最終物質(zhì)的降解等過程?，F(xiàn)在研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬在許多真核生物如絲狀真菌、植物、果蠅、線蟲、昆蟲、人的生理病理方面都發(fā)揮著重要的作用。而細(xì)胞凋亡是生物體內(nèi)由基因控制的主動(dòng)死亡的過程，大量研究表明它在生長發(fā)育及致病性等方面發(fā)揮著重要功能，但大豆疫霉的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬還知之甚少。
　　為了研究大豆疫霉中是否發(fā)生細(xì)胞自噬，之前研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。通過PEG介導(dǎo)的大豆疫霉的穩(wěn)定

3、轉(zhuǎn)化獲得GFP-PsAtg8的過表達(dá)轉(zhuǎn)化子，通過雷帕霉素處理前后GFP-PsAtg8融合蛋白的位置變化來觀察細(xì)胞自噬的發(fā)生。熒光顯微鏡觀察結(jié)果表明對(duì)照組(DMSO)的菌絲熒光聚集較亮，而雷帕霉素處理后的菌絲中熒光分散，說明菌絲確實(shí)發(fā)生了細(xì)胞自噬。同時(shí)通過MDC染色法觀察大豆疫霉細(xì)胞自噬的發(fā)生，它是一種廣泛使用的自噬熒光染料。結(jié)果顯示與對(duì)照相比，經(jīng)雷帕霉素處理的菌絲中自噬體數(shù)量增多，熒光亮點(diǎn)增加。這兩種方法說明大豆疫霉中可以發(fā)生細(xì)胞自噬。

4、為了進(jìn)一步探究細(xì)胞自噬是否參與到大豆疫霉的不同生長發(fā)育階段，利用MDC染色的方法觀察大豆疫霉不同生長發(fā)育階段細(xì)胞自噬的發(fā)生，包括菌絲、孢子囊形成、休止胞以及休止胞萌發(fā)。結(jié)果表明MDC染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)初生孢子囊中MDC熒光強(qiáng)，而成熟的孢子囊的MDC熒光較弱。休止胞以及休止胞萌發(fā)階段MDC染色結(jié)果顯示休止胞的MDC熒光較弱，而休止胞萌發(fā)時(shí)MDC熒光增強(qiáng)，說明在孢子囊形成，休止胞萌發(fā)時(shí)細(xì)胞自噬過程被激活。我們由此可以推斷細(xì)胞自噬可能在大豆疫霉侵染

5、時(shí)發(fā)揮作用。
　　為了進(jìn)一步研究細(xì)胞自噬在大豆疫霉產(chǎn)胞和致病性方面的作用，在大豆疫霉中鑒定了在侵染階段持續(xù)上調(diào)表達(dá)細(xì)胞自噬相關(guān)基因PsAtg6a。通過PEG介導(dǎo)的大豆疫霉原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法獲得PsAtg6a沉默轉(zhuǎn)化子，并接種感病品種大豆黃化苗下胚軸。結(jié)果顯示與野生型P6497相比，PsAtg6a沉默后其致病力降低，用臺(tái)盼藍(lán)染侵染部位的表皮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)吸器量減少。沉默細(xì)胞自噬相關(guān)基因PsAtg6a導(dǎo)致孢子囊的產(chǎn)生減少，結(jié)合之前MDC染色

6、結(jié)果顯示的孢子囊形成階段自噬增強(qiáng)這一結(jié)論，表明細(xì)胞自噬在孢子囊形成階段發(fā)揮重要的作用。通過上述研究，我們?cè)诖蠖挂呙怪谐醪阶C明了細(xì)胞自噬的發(fā)生，并且發(fā)現(xiàn)細(xì)胞自噬可能參與大豆疫霉孢子囊產(chǎn)生以及致病性，這些結(jié)果將會(huì)加深我們對(duì)大豆疫霉中細(xì)胞自噬對(duì)其生長發(fā)育和致病性影響的認(rèn)識(shí)。
　　為了研究另一種程序性細(xì)胞死亡-細(xì)胞凋亡在大豆疫霉侵染過程中可能的作用，在大豆疫霉中鑒定到了四個(gè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因:PsCYCS、PsEndoG和PsAIF, Ps

7、TatDs，其中PsTatDs包括PsTatD1，PsTatD2，PsTatD3和PsTatD4。通過熒光定量PCR方法分析這7個(gè)基因在大豆疫霉侵染過程中的表達(dá)情況。PsAIF在侵染階段上調(diào)表達(dá)，PsEndoG在侵染前期有輕微上調(diào)表達(dá)，PsCYCS在侵染階段下調(diào)表達(dá)，PsTatD2和PsTatD3在侵染階段上調(diào)表達(dá)，PsTatD4在侵染前期下調(diào)表達(dá)而在侵染后期上調(diào)表達(dá)。結(jié)果顯示PsEndoG，PsCYCS和PsAIF，PsTatD2，P