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文檔簡介
1、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)可危害一些重要經(jīng)濟作物,造成巨大的經(jīng)濟損失。目前細胞自噬在灰葡萄孢中的研究較少,在真核生物中,細胞自噬過程可維持細胞內(nèi)的生理平衡,有助于細胞度過逆境,并影響一些絲狀真菌細胞的分化及致病力。本研究在灰葡萄孢基因組數(shù)據(jù)庫中下載3個自噬相關(guān)基因的序列,即BC1G_12424、BC1G_11270和BC1G_01868,對其進行了基因結(jié)構(gòu)和同源性分析,采用Split-marker技術(shù)在野生型菌株B05
2、.10中對其分別進行了敲除,最后對敲除突變體的菌絲生長、菌核產(chǎn)生、營養(yǎng)需求和致病力等方面進行了測定。取得的研究結(jié)果如下:
(1)通過在NCBI上BLAST比對以及構(gòu)建進化樹,證實了BC1G_12424、BC1G_11270和BC1G_01868分別與多物種的自噬基因ATG26、ATG17和ATG14有同源性,因此命名為BcATG26、BcA TG17和BcA TG14。
(2)通過Split-marker技術(shù)分別敲除
3、基因BcATG26、BcA TG17和BcATG14,經(jīng)過PCR和Soutnern blot驗證,獲得了基因缺失突變體△BcATG26、△BcA TG17和△BcATG14。
(3)明確了自噬基因BcATG26、BcA TG17和BcA TG14在自噬過程中的重要作用。用MDC染色,B05.10的菌絲在激光共聚焦顯微鏡下出現(xiàn)大量的熒光顆粒,而△BcATG26-13、△BcATG17-6和△BcATG14-107的菌絲細胞中未見
4、或者有極少數(shù)的熒光顆粒,自噬基因的敲除阻斷了自噬過程,導(dǎo)致不能形成自噬體或者自噬小體。
(4)細胞自噬影響灰葡萄孢菌絲生長和菌核發(fā)育?;蛉笔蛔凅w在菌絲生長和菌核形成方面與野生型菌株B05.10有差異。在PDA培養(yǎng)基上,△BcA TG26-13相對于野生型菌株B05.10,菌核黑化延遲,15d仍為黃色;而△BcATG14-107只能形成很小的菌核。在1/8 PDA、DM、DM-C和DM-N培養(yǎng)基上,與野生型菌株B05.10相
5、比,△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107菌絲生長速度減慢,菌落發(fā)育畸形。
(5)細胞自噬影響灰葡萄孢致病力。用菌絲塊離體接種煙草葉片、活體接種煙草葉片和離體接種草莓葉片測定致病力,結(jié)果表明,△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107的致病力與野生型菌株B05.10相比有極顯著差異(P<0.01)。
(6)細胞自噬可能影響灰葡萄孢耐受過氧化氫(H2O
6、2)和植保素(camalexin)的脅迫。在添加有H2O2或者植保素camalexin的PDA上,與野生型菌株B05.10相比,△BcATG26-13、△BcA TG17-6和△BcA TG14-107菌絲生長速度減慢,菌落發(fā)育畸形,即對H2O2和camalexin更為敏感。
以上結(jié)果表明,細胞自噬在灰葡萄孢菌絲生長、菌核的形成和發(fā)育、對寄主植物的致病力以及病原菌耐受活性氧(ROS)和植保素camalexin的脅迫等方面都起著
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