灰葡萄孢BcPDR1基因在病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中的功能.pdf

1、本實(shí)驗(yàn)室前期從灰葡萄孢ATMT突變體庫(kù)中篩選獲得了一株致病力喪失的突變體BCt89，明確了其突變基因?yàn)锽cPDR1;利用基因敲除技術(shù)，初步確定了BcPDR1基因在灰葡萄孢生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中的作用，本研究進(jìn)一步利用互補(bǔ)回復(fù)技術(shù)，在BcPDR1基因敲除突變體ΔBcPDR1的基礎(chǔ)上，創(chuàng)制了該基因的回復(fù)突變體ΔBcPDR1/BcPDR1;通過對(duì)野生型BC22、T-DNA插入突變體BCt89、敲除突變體ΔBcPDR1和回復(fù)突變體ΔBcPDR1/

2、BcPDR1的表型和致病力進(jìn)行分析，明確BcPDR1基因在灰葡萄孢生長(zhǎng)發(fā)育和致病過程中的功能;通過對(duì)突變體BCt89、ΔBcPDR1和ΔBcPDR1/BcPDR1的致病因素（胞壁降解酶、毒素、產(chǎn)酸能力）、信號(hào)途徑相關(guān)基因及致病相關(guān)基因的表達(dá)情況進(jìn)行分析，確定BcPDR1基因調(diào)控病菌致病力的機(jī)制;通過檢測(cè)突變體BCt89、ΔBcPDR1和ΔBcPDR1/BcPDR1對(duì)非生物脅迫的敏感性，明確BcPDR1基因?qū)Σ【巧锩{迫的影響。研究結(jié)果

3、為闡明BcPDR1基因調(diào)控病菌生長(zhǎng)發(fā)育和致病的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，并為灰霉病的防治及新型殺真菌制劑的研制提供理論依據(jù)和實(shí)踐基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.利用Real-time PCR技術(shù)，對(duì)BcPDR1基因在灰葡萄孢野生型菌株BC22的不同生長(zhǎng)時(shí)期、不同部位的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，確定了BcPDR1基因在病菌的菌絲、分生孢子和菌核中均有表達(dá)，在菌核和分生孢子中的表達(dá)水平較高，在菌絲中的表達(dá)水平相對(duì)較低。
　　2.利用基因互補(bǔ)

4、回復(fù)技術(shù)，成功構(gòu)建了BcPDR1基因的表達(dá)載體pBARKS1-BcPDR1-eGFP;利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)，將pBARKS1-BcPDR1-eGFP載體遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)BcPDR1基因敲除的突變體ΔBcPDR1中;利用草銨磷抗性對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行篩選，并利用PCR、Southern blotting、RT-PCR、Real-time PCR等技術(shù)對(duì)所得轉(zhuǎn)化子進(jìn)行鑒定，確定了試驗(yàn)所獲得的轉(zhuǎn)化子為BcPDR1基因的回復(fù)突變體ΔBcPDR1/BcPDR1

5、。
　　3.以灰葡萄孢野生型BC22作為對(duì)照，對(duì)BcPDR1基因的T-DNA插入突變體BCt89、敲除突變體ΔBcPDR1和回復(fù)突變體ΔBcPDR1/BcPDR1的表型進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變體BCt89和ΔBcPDR1的生長(zhǎng)速率緩慢，菌落呈白色，且不產(chǎn)生菌核，菌絲顏色較淺、相對(duì)纖細(xì)、分隔短，不產(chǎn)生分生孢子;而野生型菌株和回復(fù)突變體的菌落呈灰白色，有菌核和分生孢子產(chǎn)生，菌絲顏色較深、分隔較長(zhǎng)。表明BcPDR1基因正調(diào)控灰葡萄孢菌絲生長(zhǎng)、

6、分生孢子和菌核的生成。
　　4.對(duì)突變體BCt89、ΔBcPDR1和ΔBcPDR1/BcPDR1的致病力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)野生型菌株和回復(fù)突變體均能在番茄果實(shí)和擬南芥葉片上產(chǎn)生明顯的病斑，而突變體BCt89和ΔBcPDR1在番茄果實(shí)和擬南芥葉片上均不能形成病斑，且在接種BCt89和ΔBcPDR1的擬南芥葉片中灰葡萄孢BcACTIN基因的表達(dá)水平顯著低于接種野生型和回復(fù)突變體的葉片，表明BcPDR1基因正調(diào)控灰葡萄孢的致病力。
　

7、　5.對(duì)突變體BCt89、ΔBcPDR1和ΔBcPDR1/BcPDR1的胞壁降解酶活性、毒素和產(chǎn)酸能力進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)突變體BCt89和ΔBcPDR1的乳糖醛酸酶(PMG)、乳糖醛酸酶(PG)和纖維素酶(Cx)酶活性較野生型菌株和回復(fù)突變體ΔBcPDR1/BcPDR1的明顯降低，而多聚半乳糖醛酸反式消除酶(PGTE)和果膠甲基反式消除酶(PMGE)的酶活性與野生型菌株和回復(fù)突變體沒有顯著性差別。突變體BCt89、ΔBcPDR1的毒素活性較

8、野生型和回復(fù)突變體明顯降低，產(chǎn)酸能力明顯減弱，表明BcPDR1基因正調(diào)控病菌的胞壁降解酶PMG、PG和Cx的活性、毒素活性和產(chǎn)酸能力。
　　6.利用Real-time PCR技術(shù)，對(duì)灰葡萄孢野生型BC22和突變體BCt89、ΔBcPDR1、ΔBcPDR1/BcPDR1中信號(hào)途徑相關(guān)基因和致病相關(guān)基因的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，突變體BCt89和ΔBcPDR1中信號(hào)途徑相關(guān)基因Bcp1、edka的表達(dá)水平明顯降低，pka、pka2

9、、bac、ras2基因的表達(dá)量明顯升高;突變體BCt89和ΔBcPDR1中致病相關(guān)基因lac1、P450-1、god1、cutA基因的表達(dá)水平明顯降低，btp1、bcbot1、glyox1、bcpg1和bcpg2基因的表達(dá)水平明顯高于野生型和回復(fù)突變體，表明BcPDR1基因參與調(diào)控灰葡萄孢信號(hào)途徑相關(guān)基因和致病相關(guān)基因的表達(dá)。
　　7.對(duì)灰葡萄孢野生型BC22和突變體BCt89、ΔBcPDR1、ΔBcPDR1/BcPDR1響應(yīng)非生