CmAvaB基因在盾殼霉發(fā)育和產(chǎn)孢過程中的功能分析.pdf

1、盾殼霉(Coniothyrium minitans)是植物病原菌核盤菌(Sclerotinia sclerotirium)的重寄生真菌，寄生核盤菌的菌絲和菌核，是作物菌核病重要的生防菌。本文以盾殼霉ZS-1菌株的T-DNA插入標(biāo)記的生長缺陷型突變體ZS-1N22225為材料，克隆并驗(yàn)證了生長產(chǎn)孢相關(guān)基因CmAvaB的功能，其結(jié)果如下：
　　 與出發(fā)菌株ZS-1相比，突變體ZS-1N22225菌絲致密，菌絲偏向于培養(yǎng)基基質(zhì)中生長，

2、生長減慢，產(chǎn)孢量約為出發(fā)菌株ZS-1的86%，寄生致腐菌核的能力為ZS-1的69.2%，但產(chǎn)抗細(xì)菌物質(zhì)的能力增強(qiáng)。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)菌絲細(xì)胞內(nèi)液泡結(jié)構(gòu)不完整，呈碎片狀分布。在PDA中添加胡蘿卜汁或核盤菌菌核碎片后，可使其產(chǎn)孢能力增強(qiáng)，產(chǎn)孢量增加1%-5%。
　　 實(shí)驗(yàn)室前期通過反向PCR獲得突變體ZS-1N22225的T-DNA插入側(cè)翼DNA片段，結(jié)合盾殼霉的全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)T-DNA插入在一個全長為3315bp的基因的啟動

3、子中間。通過Softberry進(jìn)行閱讀框(ORF)和蛋白編碼預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該基因包含3個外顯子和2個內(nèi)含子，編碼一個1071 aa的蛋白。該基因在盾殼霉基因組中是單拷貝。將推定的蛋白氨基酸序列在NCBI上進(jìn)行同源性比較，該序列與小球腔菌、小麥德氏霉和黃曲霉等真菌的AVBA蛋白的同源性分別為93%、96%和77%，因此在盾殼霉中將該基因命名為CmAvaB。
　　 通過RT-PCR驗(yàn)證CmAvaB基因在出發(fā)菌株ZS-1中第48h表達(dá)量最

4、高，在突變體ZS-1N22225中表達(dá)量少。因此在突變體ZS-1N22225中CmAvaB基因只是部分功能破壞。為了研究該基因的功能，構(gòu)建了CmAvaB基因的敲除載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化ZS-1菌株，得到了敲除轉(zhuǎn)化子KO20、KO41和KO239這3株突變體。研究發(fā)現(xiàn)敲除轉(zhuǎn)化子生長緩慢，產(chǎn)孢減少且寄生能力下降。通過電鏡觀察發(fā)現(xiàn)其敲除轉(zhuǎn)化子液泡結(jié)構(gòu)不完整，成碎片狀；由液泡形態(tài)改變造成了對滲透壓與酸堿脅迫的敏感性改變。敲除轉(zhuǎn)化子對

5、0.1M山梨醇抗逆性增強(qiáng)，生長加快，而ZS-1在此條件下生長受阻；對氯化鈉與酸堿脅迫下都敏感，生長緩慢。構(gòu)建了CmAvaB基因的互補(bǔ)載體，轉(zhuǎn)化敲除突變體KO20，獲得了互補(bǔ)轉(zhuǎn)化子C6和C9?；パa(bǔ)轉(zhuǎn)化子的表型、生長速度、產(chǎn)孢能力與寄生能力都和出發(fā)菌株的無顯著差異。表明CmAvaB基因與盾殼霉的生長發(fā)育相關(guān)，影響其生長、產(chǎn)孢和寄生能力等生長發(fā)育過程。
　　 綜上研究表明CmAvaB既可以維持液泡形態(tài)和功能，并在盾殼霉生長發(fā)育和產(chǎn)孢過