生防菌盾殼霉LaeA基因的克隆與功能研究.pdf

1、核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.) de Bary）是一種世界廣泛分布危害嚴重的病原真菌，至少能造成400多種植物發(fā)病。生防菌盾殼霉（Coniothyriumminntans）是核盤菌的一種重寄生真菌，對核盤菌引起的作物菌核病有很好的生防潛力。盾殼霉可以通過抗生作用或重寄生作用來控制核盤菌，而盾殼霉的抗生作用或重寄生作用受環(huán)境pH值的調(diào)控。LaeA是一種全局性的次級代謝調(diào)控因子，可以調(diào)控真菌的次級代謝和

2、發(fā)育，例如在Aspergillus、Fusarium、Penicillium和Trichoderma屬等真菌中已有報道。但在盾殼霉中還沒有LaeA基因及其功能研究的相關(guān)報道。那么LaeA在盾殼霉的次級代謝和發(fā)育中有何作用？本研究采用簡并引物同源擴增技術(shù)從盾殼霉基因組中克隆得到CmlaeA基因，并通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)對CmlaeA基因進行敲除和互補，最后對CmlaeA在盾殼霉重寄生和抗生作用中的功能進行了研究。主要內(nèi)容包括：<

3、br>　?、艔亩軞っ挂吧途闏hy-1中克隆到LaeA基因及其啟動子序列，將其命名為CmlaeA（GenBank登錄號:KP998106）。CmlaeA基因全長2017bp，包含6個外顯子，5個內(nèi)含子，1749bp的開放閱讀框共編碼583個氨基酸。對其氨基酸序列進行分析發(fā)現(xiàn)，CmlaeA氨基酸序列中含有LaeA蛋白的保守結(jié)構(gòu)域（S-腺苷甲硫氨酸結(jié)合域）。系統(tǒng)進化分析結(jié)果表明:CmlaeA與Pyrenophoratritici-repe

4、ntis的LaeA親緣關(guān)系最近，氨基酸同源性高達80％。qRT-PCR試驗結(jié)果表明CmlaeA在24 h黑暗條件下增強表達，CmlaeA在24 h光照條件下的表達量僅為24 h黑暗條件下的0.179倍。
　　⑵通過同源重組技術(shù)獲得了CmlaeA的敲除突變體ΔCmlaeA-2和互補轉(zhuǎn)化子ΔCmlaeA-2C。不論在光照還是黑暗條件下，各突變體在PDA平板上菌絲生長速率與野生型無顯著差異，但CmlaeA敲除突變體不能產(chǎn)生分生孢子器與分

5、生孢子，而且其菌落的表面疏水性喪失?？梢?，CmlaeA顯著影響盾殼霉分生孢子器、分生孢子的產(chǎn)生和菌落表面疏水性，而且這些生物學(xué)特性不受光照調(diào)控。
　?、敲鞔_了CmlaeA對盾殼霉重寄生作用的影響。重寄生試驗結(jié)果表明，CmlaeA敲除突變體對核盤菌菌絲和菌核的寄生能力顯著低于野生型和互補轉(zhuǎn)化子ΔCmlaeA-2C。進一步檢測重寄生相關(guān)酶的產(chǎn)生情況，CmlaeA敲除突變體產(chǎn)生的胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶顯著低于野生型和互補轉(zhuǎn)化子Δ

6、CmlaeA-2C。因此，CmlaeA基因的敲除導(dǎo)致盾殼霉產(chǎn)生重寄生相關(guān)酶（胞外蛋白酶、幾丁質(zhì)酶和葡聚糖酶）的能力下降，從而顯著降低了盾殼霉對核盤菌的重寄生能力。
　　⑷研究了CmlaeA對盾殼霉抗生作用的影響。在PDB搖培條件下，敲除突變體ΔCmlaeA-2產(chǎn)生的抗真菌物質(zhì)顯著高于野生型和互補轉(zhuǎn)化子ΔCmlaeA-2C，同時CmlaeA敲除突變體培養(yǎng)濾液的pH值顯著低于野生型和互補轉(zhuǎn)化子ΔCmlaeA-2C。在MCD緩沖pH值條

7、件下，只有在pH值為5.0的條件下，CmlaeA敲除突變體的培養(yǎng)濾液幾乎沒有抑菌活性，顯著低于野生型和互補轉(zhuǎn)化子;而在pH為3.0、4.0和6.0時，CmlaeA敲除突變體培養(yǎng)濾液的抑菌活性與野生型和互補轉(zhuǎn)化子沒有顯著差異，而且各盾殼霉菌株在高pH值條件產(chǎn)生抗真菌物質(zhì)能力下降。因此，CmlaeA敲除突變體在PDB搖培條件下抗生活性增強可能是由于其培養(yǎng)液pH值降低所造成的。綜上所述，CmlaeA在盾殼霉與核盤菌互作中發(fā)揮重要作用，不僅影響