Hira基因在魚類卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育過程中的作用.pdf

1、Hir/Hira（histone regulation）基因是組蛋白基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，其產(chǎn)物包含一組保守的蛋白家族，廣泛存在于從酵母、果蠅、魚、爪蟾、雞、植物以及到哺乳動物小鼠和人類等多種生物體當(dāng)中。在果蠅中的研究發(fā)現(xiàn)，Hira基因與受精卵中精核的解凝和雄性原核的形成有關(guān)系，而對果蠅的存活沒有影響。然而對高等脊椎動物雞和小鼠的研究表明，Hira基因?qū)Πl(fā)育是必需的，其突變將導(dǎo)致胚胎死亡。銀鯽（Carassius auratus gib

2、elio）屬于天然雌核發(fā)育兩性魚類，卵子發(fā)生、受精過程以及胚胎發(fā)育具有不同于兩性生殖魚類的特征?？紤]到銀鯽受精的表型與果蠅Hira基因突變的表型類似，我們將Hira基因引入到銀鯽的發(fā)育生物學(xué)研究中，探討其在魚類卵子發(fā)生、胚胎發(fā)育和雌核發(fā)育中的調(diào)控作用。本研究組在前期的工作中已經(jīng)克隆出了銀鯽和兩性生殖彩鯽Hira基因的全長，并制備了銀鯽HIRA蛋白的的多克隆抗體。本次研究首先采用原位雜交、免疫熒光定位等方法，檢測了Hira基因mRNA和蛋

3、白質(zhì)在銀鯽和彩鯽卵子發(fā)生過程中的動態(tài)變化，然后又采用反義嗎啡林寡核苷酸（Morpholino，MO）技術(shù)敲降了HIRA蛋白的表達(dá)，觀察了HIRA蛋白表達(dá)下降對胚胎發(fā)育的影響。本次研究將為揭示雌核發(fā)育銀鯽魚的卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育中的關(guān)鍵問題提供依據(jù)，而且會大大豐富發(fā)育生物學(xué)的理論知識，促進(jìn)魚類基因功能方面的進(jìn)一步研究。 銀鯽和彩鯽卵子發(fā)生過程中Hira基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的變化基本一致，在Ⅰ期卵母細(xì)胞的細(xì)胞核中大量表達(dá)，至Ⅱ期卵母細(xì)胞時(shí)轉(zhuǎn)至

4、細(xì)胞質(zhì)中均勻分布，在Ⅲ期卵母細(xì)胞中，雜交信號逐漸移向細(xì)胞的周邊，到Ⅳ期時(shí)隨著卵黃物質(zhì)大量積累，雜交信號幾乎不見。HIRA蛋白在銀鯽和彩鯽卵子發(fā)生過程中的變化略有差別，即在彩鯽中出現(xiàn)得較早。HIRA蛋白在銀鯽I期卵母細(xì)胞中沒有表達(dá)，在Ⅱ期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有弱表達(dá)，在Ⅲ期早期卵母細(xì)胞的周邊有強(qiáng)烈表達(dá)。而在彩鯽Ⅰ期卵母細(xì)胞中就有HIRA蛋白的弱表達(dá)，在Ⅱ期時(shí)HIRA蛋白在細(xì)胞質(zhì)中大量表達(dá)，Ⅲ期早期卵母細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中有弱表達(dá)。在銀鯽和彩鯽Ⅲ期

5、末和Ⅳ期卵母細(xì)胞中都很難觀察到熒光信號。其原因可能是后期卵母細(xì)胞體積急劇增大，以至于Hira基因產(chǎn)物的相對密度下降，用原位雜交和免疫熒光染色的方法很難觀察到。Hira mRNA和蛋白質(zhì)在銀鯽和彩鯽早期卵母細(xì)胞中有較強(qiáng)表達(dá)，且在銀鯽和彩鯽卵子發(fā)生過程中沒有顯著差異，說明其可能對于脊椎動物卵子發(fā)生和減數(shù)分裂沒有顯著影響，而是在受精或胚胎發(fā)育過程中起作用。 在銀鯽受精后1細(xì)胞期，采用反義嗎啡林寡核苷酸（Morpholino，MO）敲降

6、（Knock down）的方法研究了Hira基因?qū)︺y鯽胚胎發(fā)育的影響。Western Blot分析發(fā)現(xiàn)，早期注射Hira-MO組與對照組胚胎中HIRA蛋白的表達(dá)沒有明顯差異，但到心跳期，Hira-MO注射組的蛋白表達(dá)開始明顯下降，雖然在孵化期蛋白表達(dá)水平又得以恢復(fù)，但還是引起了嚴(yán)重的胚胎發(fā)育缺陷，注射組胚胎在原腸作用過程中，下包速度較對照組慢，圍心腔水腫，卵黃吸收產(chǎn)生障礙，尾部扭曲變形，血液循環(huán)受阻等。胚胎在出苗前就大量死亡。少數(shù)可以孵