斑馬魚Z-OTU蛋白在卵子發(fā)生和胚胎發(fā)育早期的表達.pdf

1、斑馬魚(Danio rerio)是脊椎動物發(fā)育生物學和遺傳學研究的重要模式動物,其卵子發(fā)生及早期胚胎發(fā)育過程的調控機制已經引起越來越多研究者們的高度重視。最近的研究表明,泛素-蛋白酶體途徑(Ubiquitin-proteasome pathway,UPP)參與了哺乳動物卵子發(fā)生和早期胚胎發(fā)育過程的許多重要事件,如卵母細胞生發(fā)泡破裂、第一極體的排放、MⅡ阻滯的維持和克服等。UPP途徑是真核生物細胞內一種高效的蛋白質降解途徑,能夠參與體內許

2、多重要的生物學功能,包括細胞周期、胚胎發(fā)育、生長控制、凋亡、神經元退化等,其表達異常可以引發(fā)許多疾病。去泛素化酶(Deubiqitinating enzymes,DUBs)是UPP的重要組分,具有調控UPP的重要作用。目前,在斑馬魚中還未見任何有關DUB的報道。
　　 我們研究的斑馬魚otu基因(簡稱Z-otu,下同)編碼的蛋白可能具有DUBs活性,它具有一個典型的otu保守框,屬于otu-like半胱氨酸蛋白酶家族的成員。Z-

3、otu不僅是一個斑馬魚卵巢特異表達的基因,而且還是一個卵子發(fā)生早期和胚胎發(fā)育早期特異表達的基因。在早期卵母細胞(卵原細胞或剛分化的卵母細胞、Ⅰ-Ⅲ期卵母細胞)中,Z-otu mRNA有表達且表達量呈現出遞減的趨勢；在Ⅳ期卵母細胞和成熟的卵子(V期卵母細胞)中幾乎檢測不到該基因的表達；Z-otu mRNA在合子期到囊胚早期胚胎的胚盤細胞中表達,而在囊胚晚期之后直到5dpf(不包括5dpf)的胚胎中檢測不到表達。生物信息學分析結果顯示Z-O

4、TU是一個核蛋白,其491-514氨基酸區(qū)域存在一個長24個氨基酸的跨膜區(qū)域,預測結果還顯示該蛋白的N端位于膜外,沒有明顯的信號肽區(qū)域,表明其是一個非分泌蛋白。
　　 為了進一步分析Z-OTU蛋白的功能,本文設計了特異性引物并采用PCR擴增了該基因的otu保守域(簡稱otu1),將該片段插入pGEX-6p-1載體后,與GST標簽蛋白融合后轉化到大腸桿菌BL21中。構建好的融合表達質粒經PCR、酶切檢測和測序鑒定后,用IPTG誘導

5、并進行SDS-PAGE電泳,得到一個與預期目的蛋白分子量(42kDa)相符的條帶。將原核表達的融合蛋白純化后免疫新西蘭兔,獲得多克隆抗體anti-Z-OTU,并利用該抗體對斑馬魚卵巢和胚胎進行免疫組織化學檢測。
　　 斑馬魚卵巢免疫組化檢測結果顯示,在卵母細胞初級生長期(Ⅰ期),Z-OTU蛋白定位于生發(fā)泡(GV)內,而在細胞質中未檢測到該蛋白的表達；在stageⅡ期和stageⅢ期的卵母細胞中,Z-OTU蛋白開始向細胞質遷移,主

6、要分布在生發(fā)泡周圍、細胞質中和細胞膜上,在卵黃和皮層小泡中幾乎檢測不到該蛋白的表達；在stageⅣ期卵母細胞中,Z-OTU蛋白主要集中在生發(fā)泡的近植物端,在隨后的發(fā)育中伴隨著生發(fā)泡一起向未來的動物極遷移。整體熒光免疫組織化學檢測結果顯示Z-OTU蛋白的分布在斑馬魚胚胎發(fā)育早期隨發(fā)育階段的不同而發(fā)生變化:卵母細胞受精后,Z-OTU蛋白位于細胞質中,并伴隨著胞質流動；隨著胚胎的進一步發(fā)育,Z-OTU均勻的分布在卵裂后的各個細胞中,但是在中囊

7、胚轉換之后,Z-OTU蛋白主要分布在體節(jié)形成的部位。在斑馬魚胚胎發(fā)育早期,Z-OTU蛋白的表達量也隨發(fā)育階段的不同而發(fā)生變化:Z-OTU蛋白在30％外包期的表達量明顯低于在1000細胞期的表達量；當胚胎發(fā)育到體節(jié)期時,Z-OTU蛋白的表達量繼續(xù)降低,到13體節(jié)后已檢測不到Z-OTU蛋白。上述結果表明,Z-OTU蛋白在斑馬魚卵子發(fā)生、受精和胚胎發(fā)育早期可能有著非常重要的生物學功能。
　　 根據本研究及以前的研究,我們分析并比較了Z