NK細(xì)胞在結(jié)核分枝桿菌中的抗感染作用.pdf

1、研究背景：中性粒細(xì)胞（PMN）和自然殺傷細(xì)胞（NK）是重要的天然免疫細(xì)胞。天然免疫細(xì)胞在抗結(jié)核感染中受到更多關(guān)注，而 PMN,NK細(xì)胞在結(jié)核感染中的作用卻一直很少被注意到。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PMN NK細(xì)胞這一具有天然免疫作用的細(xì)胞可能也參與抗結(jié)核感染的免疫保護(hù)作用，但PMN在抗結(jié)核感染的免疫保護(hù)作用中的確切機(jī)制尚未明確。探討PMN NK細(xì)胞在抗結(jié)核感染的天然免疫作用的具體作用機(jī)理，以及與γδT細(xì)胞在抗結(jié)核感染中的相互調(diào)節(jié)作用,對(duì)全面了解

2、結(jié)核病的發(fā)病機(jī)制和機(jī)體抗結(jié)核感染的免疫保護(hù)機(jī)制，具有重要的理論意義和臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　目的：檢測(cè)和比較初治和復(fù)治結(jié)核病患者與健康人外周血NK細(xì)胞的數(shù)量和胞內(nèi)殺傷分子的變化。并且通過檢測(cè)健康人和肺結(jié)核患者外周血NK細(xì)胞的細(xì)胞因子的表達(dá)，PMN細(xì)胞和γδT細(xì)胞共培養(yǎng)產(chǎn)生IL17、IFN-γ的變化，探討NK細(xì)胞，PMN細(xì)胞在結(jié)核感染中的作用和意義。
　　方法：1.取健康人（112例）和結(jié)核病患者外周血145例（初治105例，復(fù)治

3、40例）?？鼓庵苋獦?biāo)本，加熒光抗體 CD3APC,CD56PE,CD8PECY5.5染色，溶血洗滌后在流式細(xì)胞儀檢測(cè)。分析采用BD公司cellquest軟件。在FSC-SSC點(diǎn)陣圖上設(shè)定淋巴細(xì)胞 R1，再以 R1設(shè)門（G1），在 CD3和 CD56點(diǎn)陣圖上作四分法（Quadrants）劃區(qū)，以CD3-CD56+區(qū)為NK細(xì)胞區(qū)，計(jì)算在淋巴細(xì)胞中的百分率。同時(shí)每份外周血標(biāo)本在 GT-1200全自動(dòng)血液分析儀上以血常規(guī)分析方法對(duì)白細(xì)胞作三

4、分類（即粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，單核細(xì)胞）計(jì)數(shù)檢測(cè)，獲得淋巴細(xì)胞絕對(duì)數(shù)，再與流式檢測(cè)的NK細(xì)胞的百分比相乘計(jì)算獲得NK細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)。
　　2.檢測(cè)胞內(nèi)殺傷分子的染色檢查在表染后作固定透膜處理，再加抗顆粒溶解素，抗顆粒酶和抗穿孔素?zé)晒饪贵w染色，透膜洗滌后再上流式儀檢測(cè)分析。
　　3．采集22例活動(dòng)性肺結(jié)核病人和18例HD外周血，加入佛波醇酯（PMA）和鈣離子霉素（Ionomycin）刺激培養(yǎng)2小時(shí)后，再加入莫能霉素（Monensin

5、）繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)，收集細(xì)胞，加入熒光標(biāo)記抗體CD3APC,CD56PE進(jìn)行表面分子染色，透膜后再加細(xì)胞因子熒光標(biāo)記單抗抗 IL17IL22和抗 IFN-γ TNF-α作細(xì)胞內(nèi)染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)分泌IL-22 IL-17和IFN-γ TNF-α的淋巴細(xì)胞亞群的比例。
　　4.取9例健康外周血各10ml采用密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），加入 Mtb-HAg和 rIL-2刺激培養(yǎng)7-10天后，使其成為富含效應(yīng)性γδ

6、T細(xì)胞的Mtb-HAg激活的T細(xì)胞（Mtb-AT），然后和 PMN共培養(yǎng)24h，收集細(xì)胞用PMA/Ionomycin和Monensin以及Mtb-HAg和Monensin刺激培養(yǎng)6小時(shí)，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)γδT分泌IL-17和IFN-γ的比例。
　　5.取10例健康外周血各10ml，分離獲得PBMC,用含5％NBS培養(yǎng)液RPM11640配成細(xì)胞懸液濃度為1.5×106∕ml，在24孔培養(yǎng)板上種5孔分別加入IL2、MTB-Ag、HDM

7、APP、MTB-Ag+IL2、HDMAPP+IL2處理，在0h，12h，36，48h，72h后染抗CD3-CD56+，然后檢測(cè)各孔NK細(xì)胞的CD69，CD25的變化。
　　結(jié)果:
　　1.初治肺結(jié)核患者外周血淋巴細(xì)胞中 NK細(xì)胞的比例(16.95±8.27)%顯著低于健康組(19.99±9.28)%和復(fù)治組(20.59±7.99)%。
　　2.健康人組（88例）外周血NK細(xì)胞絕對(duì)值計(jì)數(shù)為（44.32±26.69）×10

8、4∕ml，結(jié)核初治組（90例）為（33.31±21.44）×104∕ml，復(fù)治組（33例）為（36.8±24.97）×104∕ml。結(jié)核初治組明顯低于正常組（p＜0.05）。
　　3.結(jié)核病患者NK細(xì)胞中表達(dá)顆粒溶解素(85.78±11.63)%，穿孔素（82.88±17.05）%和顆粒酶（79.07±15.64）%和健康人組(87.31±10.34)%,(82.85±13.03)%和(88.04±7.27)%無(wú)明顯差異。而結(jié)核病

9、組CD8+T細(xì)胞中表達(dá)顆粒溶解素(28.42±16.27)%，顆粒酶（40.03±16.69）%，穿孔素（15.12±16.31）%和正常組差異不明顯。
　　4.健康人外周血NK細(xì)胞中表達(dá)IL17(21例)(1.41±1.42)%，IFN-γ(21例)(26.99±2.38)%，IL22(21例)(0.51±0.36)%，TNF-α(11例)(2.29±1.77)%和肺結(jié)核患者外周血NK細(xì)胞中產(chǎn)生IL17(22例)(2.78±2.

10、65)%，IFN-γ(20例)(37.07±3.1)%，IL22(18例)(1.61±1.46)%，TNF-α(15例)(4.08±2.17)%的比較，P均＜0.05，并且肺結(jié)核患者表達(dá)的IL17、IL22、TNF-α、IFN-γ增高。
　　5.將γδT細(xì)胞和PMN分成六個(gè)處理組,各組分別產(chǎn)生的IL17為IL2(1.13±0.36)%、MTB-Ag(1.28±0.47)%、HDMAPP(0.76±0.86)%、IL2+PMN(0.

11、98±0.58)%、MTB-Ag+PMN(0.99±0.49)%、HDMAPP+PMN(0.94±0.93)%,這六個(gè)處理組產(chǎn)生IL17沒有顯著性差異。各組分別產(chǎn)生的IFN-γ為IL2(39.6±14.52)%、MTB-Ag(56.55±10.5)%、 HDMAPP(49.15±14.33)%、 IL2+PMN(39.11±12.78)%、MTB-Ag+PMN(41.51±9.48)%、HDMAPP+PMN(51.11±14.88)%，

12、加入PMN對(duì)γδT細(xì)胞在MTB-Ag和MTB-Ag+PMN處理組中產(chǎn)生IFN-γ有影響， P＜0.05，且在MTB-Ag加入PMN后產(chǎn)生IFN-γ減少。
　　6.將PBMC分別加入IL2、MTB-Ag、HDMAPP、MTB-Ag+IL2、HDMAPP+IL2分為5組處理，NK細(xì)胞的CD69在MTB-Ag+IL2處理組中在12h達(dá)到高峰。NK細(xì)胞的CD25在MTB-Ag處理組中在48h達(dá)到高峰。
　　結(jié)論：
　　1.結(jié)核