人γδT細(xì)胞殺傷結(jié)核分枝桿菌感染THP-1細(xì)胞的研究.pdf

1、研究背景：結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的,目前仍是發(fā)病率和病死率最高的傳染病之一。Mtb寄生在巨噬細(xì)胞內(nèi)，主要引起細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。γδT細(xì)胞是與αβT細(xì)胞在許多方面有不同特征的獨(dú)特的一類T細(xì)胞，在抗結(jié)核感染免疫中可能發(fā)揮重要作用。已知γδT細(xì)胞可通過(guò)釋放細(xì)胞因子如IFN-γ激活巨噬細(xì)胞對(duì)Μtb的吞噬殺傷活性，還發(fā)現(xiàn)γδT細(xì)胞還可直接殺傷被Mtb感染的巨噬細(xì)胞，這在γδ

2、T細(xì)胞參與抗結(jié)核感染的免疫保護(hù)作用中可能有重要意義，但有關(guān)人γδT細(xì)胞殺傷Mtb感染巨噬細(xì)胞的具體機(jī)理有待進(jìn)一步探討。
　　目的：建立流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)單核巨噬細(xì)胞吞噬熒光素標(biāo)記Mtb的方法；建立Mtb感染巨噬細(xì)胞模型；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人γδT細(xì)胞對(duì)Mtb感染的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性；觀察IL-15對(duì)人γδT細(xì)胞殺傷Mtb感染巨噬細(xì)胞的影響。
　　方法：用蘇通氏液體培養(yǎng)基培養(yǎng)Mtb H37Ra，制備Mtb菌懸液，用不同濃度熒光素(F

3、ITC)標(biāo)記Mtb，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)FITC對(duì)Mtb的標(biāo)記率。FITC標(biāo)記的Mtb與人外周血單核細(xì)胞和佛波醇酯(PMA)激活分化的THP-1細(xì)胞(巨噬細(xì)胞)，共孵育不同時(shí)間后，或FITC標(biāo)記的Mtb與巨噬細(xì)胞以不同比例共孵育1 h或2 h后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) FITC陽(yáng)性的單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的數(shù)值，計(jì)算對(duì) Mtb的吞噬率；Mtb以10∶1的比例感染巨噬細(xì)胞18 h，以流式細(xì)胞術(shù)、抗酸染色和激光共聚焦顯微鏡來(lái)觀察感染模型的建立。流式細(xì)胞術(shù)檢

4、測(cè)PMA分化前后和Mtb感染后THP-1細(xì)胞表面CD14表達(dá)的變化。用Mtb-Ag刺激培養(yǎng)人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增γδT細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)Mtb抗原活化的T細(xì)胞?(MtbAT)中的γδT細(xì)胞百分率，大于85％時(shí)，作為效應(yīng)細(xì)胞用于γδT細(xì)胞對(duì)Mtb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性實(shí)驗(yàn)。用不同濃度羧基熒光素二醋酸鹽酸琥珀酰亞胺酯(CFSE)標(biāo)記 Mtb感染的巨噬細(xì)胞，作為靶細(xì)胞。將效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞以不同比例共孵育4 h，用碘化丙啶

5、(PI)染色后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)CSFE和PI雙陽(yáng)性細(xì)胞為殺傷的靶細(xì)胞，計(jì)算γδT細(xì)胞對(duì)Mtb感染巨細(xì)胞的細(xì)胞毒活性；并檢測(cè)IL-15作用γδT細(xì)胞24 h后，γδT細(xì)胞對(duì)Mtb感染巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性的影響。
　　結(jié)果：
　　1. FITC(50μg/ml)與Mtb作用2 h時(shí)對(duì)Mtb的標(biāo)記率達(dá)92%。人單核細(xì)胞對(duì)FITC標(biāo)記Mtb的吞噬率從孵育時(shí)間10 min時(shí)的35%增加至120 min的80%。巨噬細(xì)胞對(duì)FITC-

6、Mtb的吞噬率從1 h的30%增加至6 h的81%。未加臺(tái)盼藍(lán)淬滅時(shí)，單核細(xì)胞在10 min和120 min對(duì)FITC-Mtb的吞噬率與加臺(tái)盼藍(lán)淬滅相比，分別增加29%和6%；巨噬細(xì)胞在1 h和6 h對(duì)FITC-Mtb的吞噬率與加臺(tái)盼藍(lán)淬滅相比分別增加1%和7%。
　　2.巨噬細(xì)胞與FITC-Mtb共孵育1 h時(shí)，巨噬細(xì)胞與Mtb比例從1∶1增加至1∶100，其吞噬率則從6.5%增加至85.1%，巨噬細(xì)胞與FITC-Mtb共孵育2

7、 h時(shí)，巨噬細(xì)胞與Mtb比例從1∶1增加至1∶100，其吞噬率則從12.8%增加至89.9%。
　　3. THP-1細(xì)胞表達(dá)CD14的陽(yáng)性率為4.5%，PMA作用后，CD14陽(yáng)性率為22.3%，差異顯著(P<0.01)。Mtb感染后，CD14陽(yáng)性率增加至27.5%，差異顯著(P<0.01)。
　　4.人γδT細(xì)胞與THP-1細(xì)胞以1∶1至50∶1的比例作用4 h后，γδT細(xì)胞對(duì)THP-1細(xì)胞的細(xì)胞毒活性從16.1%增加至47

8、.2%，人γδT細(xì)胞與Mtb感染的巨噬細(xì)胞以1∶1至50∶1的比例作用4 h后，γδT細(xì)胞對(duì)Mtb感染的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性從22.5%增加至80.7%。
　　5.人γδT細(xì)胞與IL-15共孵育24 h后與Mtb感染的巨噬細(xì)胞以10∶1的比例作用4 h，γδT細(xì)胞對(duì)Mtb感染的巨噬細(xì)胞的細(xì)胞毒活性為64.1%，高于無(wú)IL-15刺激的46.8%，差異有顯著性(P<0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.流式細(xì)胞術(shù)可用于檢測(cè)人外

9、周血單核細(xì)胞和激活的巨噬細(xì)胞系（ΤΗP?1)對(duì)FITC標(biāo)記Mtb的吞噬率，可反映吞噬率與單核巨噬細(xì)胞與Mtb作用時(shí)間和比例有相關(guān)性，流式細(xì)胞術(shù)是測(cè)定單核巨噬細(xì)胞對(duì)Mtb吞噬活性的好方法。
　　2. PMA作用后的THP-1細(xì)胞，表達(dá)CD14的THP-1細(xì)胞的陽(yáng)性率升高；Mtb可以誘導(dǎo)THP-1細(xì)胞表達(dá)CD14增加。
　　3.人γδT細(xì)胞對(duì)Mtb感染巨噬細(xì)胞的殺傷活性明顯高于對(duì)未感染Mtb巨噬細(xì)胞的作用，且殺傷活性隨效靶比的增