尼羅羅非魚白血病抑制因子(lif)cDNA的分離鑒定、可溶性表達及其生物學活性.pdf

1、白血病抑制因子Lif(Leukemia inhibitory factor)最早于1988年在小鼠KrebsⅡ腹水瘤細胞條件培養(yǎng)液中分離純化，因其能誘導白血病細胞株M1細胞向正常細胞分化而得名，它是白細胞介素6(IL-6)亞家族的重要成員。哺乳動物的大量研究顯示，Lif具有廣泛的生物學功能，在神經(jīng)元的存活、形成與修復、血細胞生成、激素產(chǎn)生、胚胎發(fā)育等方面均具有重要作用。近年來，Lif被大量應用于臨床及科研，具有極大的市場需求量。在臨床上

2、Lif被用于預防癌癥病人化療引起的神經(jīng)病變、促進不孕婦女移植胚胎的著床等，在科研中被廣泛應用于神經(jīng)干細胞、胚胎干細胞、誘導多能干細胞等的體外培養(yǎng)，是維持其未分化狀態(tài)的必需因子，占干細胞體外培養(yǎng)成本的90％以上。因此，如何能夠大量獲得具有生物學活性的Lif顯得尤為必要。目前，Lif的重組表達主要問題是表達量低，原核表達主要以包涵體形式，難以獲得具有生物學活性的蛋白。低等脊椎動物硬骨魚類是否存在哺乳類Lif的同源分子，其功能如何，尚待研究。

3、本研究以羅非魚（在本研究中，如未特殊說明，用于實驗研究的羅非魚均指尼羅羅非魚(Oreochromisniloticus)）為實驗對象，分離、鑒定lif的cDNA序列，并通過半定量RT-PCR方法檢測其在胚胎發(fā)育及不同組織中的表達模式;構建pET22、pET28a及pSUMO(small ubiquitin-related modifier)原核表達載體，獲得可溶狀態(tài)的純化蛋白ntLif32-221，并對其生物學功能進行初步研究。

4、　　另一方面，魚類性腺細胞由體細胞與生殖細胞組成，其中體細胞包括卵巢的顆粒細胞、鞘膜細胞、間質細胞，及精巢的Sertoli細胞、Leydig細胞等，自世界上首株魚類細胞系即虹鱒（Oncorhynchus mykiss）性腺細胞系RTG-2建立以來，目前僅在少數(shù)魚類如青鳉、牙鲆、南方鲇等建立了性腺的細胞系。羅非魚是研究魚類性別決定與分化的良好動物模型，其性腺細胞系的建立將為生殖細胞增殖與分化、相關功能基因研究等提供有力手段。迄今，尚未見羅

5、非魚性腺來源細胞系建立的相關報道?；诖耍狙芯窟€開展了羅非魚精巢、卵巢體細胞與生殖細胞體外培養(yǎng)條件及其生殖細胞移植的初步探索。主要研究結果如下:
　　1.羅非魚白血病抑制因子(ntlif) cDNA的分離鑒定、可溶性表達及其生物學活性
　　1.1通過生物信息學分析與RT-PCR方法相結合，從羅非魚克隆白血病抑制因子cDNA序列，結果顯示:ntlif由3個外顯子組成，cDNA全長1067 bp，其中5'端UTR153bp，3

6、'端UTR248bp，ORF666 bp，編碼221個氨基酸，第1-31位為信號肽序列，具有兩個鏈內(nèi)二硫鍵，兩個N-糖基化位點，與哺乳類結構特征類似;系統(tǒng)進化分析表明，ntlif為哺乳類Lf/Osm的直系同源基因;氨基酸多重序列分析表明，羅非魚Lif與魚類的氨基酸一致性達35.5％以上，而與哺乳動物Lif的氨基酸一致度僅約為18.0％，保守性較低，lif基因存在種屬特異性。ntLif蛋白理論分子量為21.294KDa，等電點為8.83。

7、
　　1.2通過RT-PCR檢測結果顯示，從受精后12 h至第5天均有l(wèi)if較高水平的表達，提示ntLif可能在羅非魚胚胎發(fā)育的整個過程中發(fā)揮生物學效應。與此同時，ntLif廣泛表達于成年魚不同組織，其中心臟、脾臟、腸、肌肉表達水平較高。
　　1.3成功構建了羅非魚除信號肽第1-31位氨基酸的Lif32-221原核重組表達載體pET22、pET28a及pSUMO，將其轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)，通過不同濃度

8、1PTG、不同溫度、不同時間誘導，SDS-PAGE及Western-blot檢測，結果顯示，pSUMO-ntLif32-221轉化陽性菌經(jīng)0.2 mM IPTG16℃誘導20 h，可獲得重組蛋白His6-SUMO-Lif32-221最大可溶性表達，特異性條帶對應分子量約37kD與理論值相符;經(jīng)Ni柱親和層析及ULP1酶解，獲得了去His6-SUMO的純化蛋白ntLif32-221，特異性條帶對應分子量約25 kD與理論值相符，產(chǎn)量約10

9、 mg/L。
　　1.4通過FACS、CCK8法檢測純化蛋白ntLif32-221對青鳉胚胎干細胞(MES1)增殖活性的影響，結果顯示，純化蛋白ntLif32-221可促進MES1的增殖。
　　2.羅非魚性腺細胞培養(yǎng)及生殖細胞移植
　　2.1取3月齡羅非魚精巢、卵巢組織經(jīng)膠原蛋白酶V及胰蛋白酶-EDTA消化，于28℃進行培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，羅非魚性腺細胞在L-15條件培養(yǎng)基中生長狀態(tài)良好，其成分為:含15％胎牛血清(FBS

10、)、25mM Hepes、1％非必需氨基酸、0.5mMβ-巰基乙醇、白血病抑制因子(Lif)、500U/mL青霉素及鏈霉素和5％羅非魚自身血清的L-15培養(yǎng)基。
　　2.2在L-15條件培養(yǎng)基中，羅非魚精巢、卵巢體細胞分離培養(yǎng)2-3天后，開始成纖維細胞樣生長，約15天后長滿單層，用0.25％的胰蛋白酶-EDTA消化，1:2進行傳代培養(yǎng)，傳代后初期細胞生長較為緩慢，平均7-10天進行傳代，傳至第9代后，細胞生長加快，平均3-6天進行

11、傳代;現(xiàn)細胞經(jīng)120 d的繼代培養(yǎng)，精巢體細胞已穩(wěn)定傳至第14代，卵巢已穩(wěn)定傳至第12代，將其分別命名為NTT、NTO。
　　2.3在L-15條件培養(yǎng)基中，羅非魚生殖細胞不貼壁或貼壁不牢，從而明顯區(qū)別于體細胞，第1周可觀察到精原細胞、卵原細胞樣的細胞增殖，約第3周可觀察到具有活性的精子的產(chǎn)生，從而表明，羅非魚生殖細胞可在體外進行有效培養(yǎng)，并完成配子的產(chǎn)生過程。
　　2.4以白硝胺與環(huán)磷酰胺處理成年雌性羅非魚(XX)以消除內(nèi)源

12、性生殖細胞為受體魚，以Hoechst33342標記雄性羅非魚(XY)生殖細胞懸液為供體細胞，將供體細胞通過生殖孔顯微注射到處理過的受體魚性腺內(nèi)，20天后取受體魚性腺組織，通過組織切片的熒光顯微觀察及PCR檢測Y性別特異標記分子，結果顯示，未能在受體魚性腺中檢測到供體細胞的信號。
　　該研究首次獲得了低等脊椎動物Lif的可溶性純化蛋白，為進一步研究其生物學功能奠定了重要基礎。此外，羅非魚性腺細胞培養(yǎng)的初步研究將促進其生殖細胞增殖與分